霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希氏菌（E．coli）中表达弓形虫表面抗原2（SAG2）,纯化制备重组蛋白rSAG2。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E．coliJMl09感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B—PER谷胱甘肽巯基转移酶（GsT）融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS—PAGE与免疫印迹（Western—blot）鉴定。结果SAG2编码基因扩增片段大小为469bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列（序列号GI：161925）完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS—PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别。结论在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性。     

变异链球菌表面蛋白PAc基因A区与霍乱毒素B亚单位融合基因植物表达载体的构建

目的构建变异链球菌表面蛋白PAc A区与霍乱毒素B亚单位的植物表达载体,为可食嵌合体防龋疫苗的进一步研究提供实验基础。方法从中间载体pBPC55获得含35s启动子、NOS终止子和多克隆位点的片段,定向连接到植物双元表达载体pCAMBIA2301上,构建重组载体p2355;通过PCR扩增从重组质粒pEAC10中获得表面蛋白PAcA区与霍乱毒素B亚单位的融合基因pacA-ctxB,克隆至重组质粒p2355中,构建植物表达载体p2355-PAcA/CTB,电转化法导入根癌农杆菌EHA105。PCR及酶切鉴定。结果 PCR扩增得到了含35s启动子、NOS终止子和多克隆位点的1.1kb大小片段,经酶切鉴定,该片段已经插入到植物双元载体pCAMBIA2301中。PCR扩增得到了pacA-ctxB基因;构建的质粒p2355-PAcA/CTB经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切及PCR检测,均得到1.7kb大小的片段,与预计的嵌合目的基因片段大小相同。结论成功构建pacA-ctxB融合基因的植物表达载体p2355-PAcA/CTB。     

人S-腺苷蛋氨酸脱羧酶α亚基的克隆、表达与纯化

目的：构建人S 腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC)的α亚基的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化表达的重组蛋白。方法：从大肠癌细胞中提取总RNA,RT PCR方法扩增人SAMDCα亚基的cDNA片段801?bp,经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx 4 SAMDC α。将重组表达质粒转化入E.coli JM109(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白,并通过6×His•Tag,利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,人SAMDC α亚基的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx 4且方向正确,SDS PAGE电泳显示表达出32kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His•Tag的融合蛋白,且Ni NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论：成功构建、表达且纯化了重组SAMDC α亚基,为制备抗SAMDC抗体、研究SAMDC基因与结直肠肿瘤的关系提供了必要的工具。     

产气荚膜梭菌α毒素亚单位基因的表达及表达产物活性分析

含有产气荚膜梭菌α毒素基因序列的克隆载体pMD18TCα ,经BamHⅠ和HindⅢ内切酶双酶切后 ,将α毒素亚单位基因亚克隆到原核表达载体pET30b中 ,构建表达载体pET30bPα。经酶切和测序鉴定 ,α毒素基因中的90 0bp的片段正确插入到表达载体中。重组菌株BL2 1(DE3)pET30bPα经IPTG诱导的表达产物经SDS PAGE和Western_blot分析 ,表达出大小为 38× 10 3的重组蛋白具有和α毒素阳性血清发生特异性的免疫反应。     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子.将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达,SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析.结果成功构建了pBV2200-P300重组质粒;SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别.结论从弓形虫基因组DNA中获取P30基因,并成功构建了pBV220-P30重组质粒,诱导表达了P30非融合蛋白.对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础.     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的：构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达。方法：采用定向克隆的方法。将PCR扩增得到的P30片段，插入原核表达质粒pBV220上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆，经过酶切及PCR扩增鉴定重组子，将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达，SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析。结果：成功构建了pBV220-P30重组质粒；SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD，且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论：从弓形虫基因组DNA中获取P30基因。并成功构建了pBV220-P30重组质粒，诱导表达了P30非融合蛋白，对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础。     

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因，构建原核重组表达质粒pThioHieA，B，C／P22，并在大肠杆菌(Top10)中进行表达及纯化融合蛋白。方法 PCR扩增及限制性内切酶Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切496bp的弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，胶回收纯化，插入表达质粒裁体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建置组体pThioHisA，B，C／P22，并转化大肠杆菌(E.coli)Topl0，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在E.coli Top10中表达，用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化．结果 PCR扩增出约496bp的P22编码基因目的片段，与预期片段大小相符；所构建的pThioHisA，B，C／P22重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定，与预期结果一致；SDS—PAGE与免疫印迹显示，表达融合蛋白产物约35．4kD．结论 成功构建弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因pThioHisA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫表面抗原P22蛋白，并纯化该融合蛋白。     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的：表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC，研究福氏志贺菌的致病机制。方法：将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21（λDE3），在异丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，对诱导后的表达产物进行SDS－PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果：诱导后的表达产物经SDS－PAGE发现有一相对分子质量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，以350mmol/L咪唑洗脱液洗脱，目的蛋白纯度可达90％以上，结论：pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定，高效地表达目的蛋白，QIA－expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便，高效的纯化系统，可获得高纯度的目的蛋白。     

肺炎嗜衣原体CPAF原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的对肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子（CPAF）基因进行原核表达,为肺炎嗜衣原体的诊断及疫苗研究奠定基础。方法利用PCR技术从肺炎嗜衣原体标准株AR-39中扩增CPAF基因,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达载体。并用双酶切、PCR及序列测定等方法进行鉴定后,在大肠杆菌中诱导表达GST融合蛋白。结果重组质粒中CPAF基因序列与肺炎嗜衣原体AR-39的同源性达到100％,CPAF在大肠杆菌中表达高效的GST融合蛋白。结论成功构建肺炎嗜衣原体CPAF基因的原核表达系统,并成功表达重组蛋白．为肺炎嗜衣原体疫苗的研究和临床检测试剂盒的研制打下基础。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

融合蛋白DT389-hIL-13的克隆表达及其抗胶质瘤作用的初步研究

目的　构建白喉毒素N端 389个氨基酸 (DT389)与人白细胞介素 13(hIL 13)的融合蛋白DT389 hIL 13,并检测其生物学活性。方法　通过聚合酶链反应 (PCR)扩增得到hIL 13的cDNA ,将序列正确的hIL 13及DT389的cDNA片段串联插入表达载体pET30a ,构建表达质粒pET30a/DT389 hIL 13,并对表达产物进行鉴定及初步纯化。该融合蛋白加入培养的U2 51胶质细胞中 ,应用MTS方法检测其对多型性胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用。结果　得到序列正确的融合蛋白DT389 hIL 13的表达质粒pET30a/DT389 hIL 13,该质粒在大肠杆菌成功表达 ,经初步纯化后 ,十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺 (SDS PAGE)凝胶电泳及Western印迹分析表明 ,该融合蛋白对白喉毒素多克隆抗体及hIL 13多克隆抗体都有很好的免疫反应性 ,相对分子质量约为 5 5 0 0 0 ;进一步活性检测发现 ,该融合蛋白对多型性胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1的生长有较强的抑制作用 ,且作用存在剂量相关性 ,其半数抑制浓度(IC50 )约为 5× 10 -11mol/L。结论　成功构建了融合蛋白DT389 hIL 13的表达质粒 ,在细胞水平对表达产物进行了初步的活性检测 ,为进一步研制特异性的抗胶质瘤药物打下了基础。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

阴道毛滴虫长寿保障基因Tv-LAG1的克隆和表达

目的克隆原生动物阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)长寿保障基因[longevityassurancegene1(LAG1)]的同源基因Tv-LAG1。构建Tv-LAG1原核表达重组体及表达其融合蛋白。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中筛选LAG1的同源基因,用pET41表达载体与Tv-LAG1cDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物用SDS-PAGE法鉴定。用纯化的融合蛋白免疫家兔,获得抗血清,采用Western-blot法对抗体特异性进行分析鉴定。结果成功构建pET41/Tv-LAG1原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白。用融合蛋白免疫家兔获得的抗体能特异性识别Tv-Lag1p/GST融合蛋白。结论Tv-Lag1p/GST融合蛋白获得高效表达,并成功纯化,初步实验证明具有一定的免疫原性,为研究Tv-Lag1p在模式生物阴道毛滴虫的细胞定位以及其功能奠定了基础。     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。