日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T／A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段，分析其核苷酸序列，为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物，采用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)方法，从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T／A克隆法，将其克隆人pMD18-T载体，经双酶切分析和PCR鉴定，将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定；运用Blast程序，将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RT—PCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带；经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18-T—SjPGK中含有所扩增的基因序列；脱氧核糖核酸序列测定和分析，SjPGK基因片段长为830bp，与SmPGK的核苷酸同源性为85％，分值为672；氨基酸同源性为94％，分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段，为进一步实验提供了条件。     

日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析

目的　克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sj PGK)编码基因片段 ,分析其核苷酸序列。方法　根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶 (Sm PGK) c DNA序列设计并合成一对引物 ,以日本血吸虫成虫总 RNA为模板 ,采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)特异性扩增 Sj PGK基因片段 ,将其克隆入p MD18- T载体中 ,经双酶切分析和 PCR鉴定 ,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用BL AST程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与 NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果　 RT- PCR特异性扩增出一条长约 830 bp的条带 ;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的 PCR均可见一条与 RT- PCR产物相同的条带 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :Sj PGK基因片段长为 830 bp,与 Sm PGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 6 72 ;氨基酸同源性为 94 % ,分值为 4 73。结论　成功地克隆了 Sj PGK编码基因片段 ,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础     

华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达

目的　构建编码华支睾吸虫3磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体,并分析其在大肠埃希菌中的表达。　方法　用Trizol法从华支睾吸虫 3成虫体内提取总RNA,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接,重组体转入JM109大肠埃希菌,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选1个阳性菌落,用异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定。　结果　用逆转录聚合酶链反应技术扩增出1条1248bp大小的片段,PCR产物测序鉴定正确;转化后得到10个克隆,双酶切、PCR扩增鉴定,其中6个为阳性克隆;表达产物用SDS PAGE鉴定,在相对分子质量70000处有1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。　结论　成功构建重组原核表达载体pGEX4T1PGK,所表达的蛋白为含有谷胱甘肽的融合蛋白     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

日本血吸虫一种新腺苷酸激酶全长cDNA的克隆与功能分析

目的：对用表达序列标签（Expression Sequence Tag,EST）策略从日本血吸虫尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行功能预测。方法：用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用NCBI BLAST站点的blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较；利用Motif Scan in a Protein Sequence对cDNA序列所编码的蛋白质进行结构域搜索；利用CD－Search程序对目标蛋白进行保守区域搜索。结果：发现一个与曼氏血吸虫22kDa单核苷酸激酶mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，基因与氨基酸水平的同一性均分别为86．0％和87．0％；蛋白结构域搜索及保守区域搜索结果显示，该cDNA序列所编码的蛋白质是一种腺苷酸激酶。结论：用EST策略筛选新基因是一个可行的方法，所筛到的日本血吸虫新基因编码一种腺苷酸激酶，全长编码序列与曼氏血吸虫腺苷酸激酶mRNA高度同源。     

日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析

目的　克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法　以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果　共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6～ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论　Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子     

蒿甲醚对小鼠体内日本血吸虫的己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的影响

目的：研究蒿甲醚（Ａｒｔ）对血吸虫己糖激酶（ＨＫ）、磷酸葡萄糖异构酶（ＧＰＩ）和磷酸果糖激酶（ＰＦＫ）的影响。方法：感染血吸虫小鼠１次ｉｇＡｒｔ１００或３００ｍｇｋｇ－１,并分别于２４ｈ和４８ｈ剖杀取虫。按生成ＮＡＤＰＨ和耗用ＮＡＤＨ的方法测定上述３种酶活力。结果：感染鼠ｉｇ．Ａｒｔ３００ｍｇｋｇ－１后２４ｈ,♀、虫体ＨＫ活力抑制率分别为３３．３％和１３．７％,ＧＰＩ活力则分别抑制１４．７％和１７．５％,４８ｈ后,♀、虫体的ＧＰＩ活力抑制率分别为４６．２％和３２．９％。但Ａｒｔ剂量为１００或３００ｍｇｋｇ－１时,给药后２４ｈ和４８ｈ的♀虫ＰＦＫ抑制率分别为６４．９％和７１％,均明显高于虫的１６．３％和５４．２％。结论：ＰＦＫ可能是Ａｒｔ作用于血吸虫糖酶解途径的靶酶之一。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫CuZn-SOD基因全长cDNA的识别及真核表达载体的构建

目的　识别日本血吸虫大陆株铜锌超氧化物歧化酶 (SjCuZn SOD)基因 ,构建SjCuZn SOD的真核表达载体。方法　将曼氏血吸虫 (Sm )的CuZn SOD全长cDNA序列上网比对 ,寻找Sj相关EST。设计特异性引物从尾蚴cDNA文库扩增相应序列 ,经双酶切、连接、转化 ,克隆入 pcDNA3 .0真核表达质粒 ,并鉴定阳性克隆。　 结果　找到Sj相关EST(登录号BU794891) ,核酸阅读框 (ORF)分析和BLAST比对分析等方法判断为SjCuZn SOD完整的cDNA编码序列 ,含462bp完整阅读框 ,编码 15 4aa。经单双酶切、PCR扩增、核酸测序鉴定 ,验证成功构建了 pcDNA3 .0 SOD真核重组表达载体。　结论　成功构建真核重组表达载体 pcDNA3 .0 SOD ,为在真核表达系统研究SjCuZn SOD基因功能奠定了基础     

日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48可变区基因的克隆及序列分析

目的克隆日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48轻链及重链可变区基因并分析其序列.方法从杂交瘤细胞NP48提取总RNA、RT-PCR扩增目的基因片段,分别克隆于pMD18-T载体,测序并作核苷酸序列分析.结果 VL基因全长336 bp,属鼠免疫球蛋白κ链第Ⅱ亚类,由种系基因he24与Jκ4重排而来.该VL 基因序列已被GeneBank收录(accession No.AY309010).VH基因全长354 bp,属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类, 由种系J558.47、Dsp2.2和JH4基因重排而来.该VH基因序列已被GeneBank收录(accession No.AY312433).结论序列比对分析表明该VL、VH基因为日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48可变区基因.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

日本血吸虫14—3—3抗原编码基因的克隆及序列测定

为了寻找日本吸虫病新的诊断和候选疫苗分子,设计合成引物,以日本血吸虫成虫cDNA第一链为模板,用PCR法扩增出日本血吸虫14－3－3抗原（Sj14-3-3）基因编码序列,其大小约784bp,将其克隆入pGEM-T载体,重组质粒pGEM-T-Sj14-3-3经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为765bp的完整开放阅读框,与曼氏血吸虫14－3－3核苷酸序列有高度同源性。本实验克隆了日本血吸虫14－3－3抗原的编码基因,并进行了序列测定,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用PCR技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到pcDNA3质粒，在HeLa细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（618bp），构建了真核表达质粒pcDNA3／ESG，在HeLa细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达24．4％，分子量约为22kDa，dot－ELISA和Westernblot分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的BALB／c小鼠脾细胞增殖，其转化率达44．57％。结论：成功地构建重组质粒pcDNA3/ESG, 并在HeLa 细胞中高效表达卵壳蛋白基因, 表达的重组蛋白具有较强的免疫活性。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因的克隆及序列分析

[目的]分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区 (VL)基因并测定其序列。 [方法 ]根据鼠免疫球蛋白轻链可变区基因FR1和FR4序列的保守性 ,化学合成用于体外扩增Ig轻链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板 ,扩增VL 基因 ,将其克隆入 pUC19载体 ,重组子用Sanger的双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与GenBank中已发表的抗体序列比较。 [结果 ]VL 基因全长 318bp ,属鼠免疫球蛋白κ轻链第IV亚类 ,由种系基因V与Jκ4 重排而来。该VL 基因序列已被GenBank收录 (accessionNo AF2 0 6 72 0 )。 [结论 ]该VL 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.