人参皂苷Rg3促树突状细胞诱导作用的实验研究

目的 研究人参皂苷Rg3联合细胞因子对单核细胞来源树突状细胞(DC)的诱导及其免疫功能的影响.方法 选取8例健康志愿者分离外周血单核细胞,利用人参皂苷Rg3联合细胞因子(GM-CSF、IL-4、TNF-α)培养14 d诱导DC,光镜和电镜观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞免疫表型,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)检测其抗原呈递能力.结果 (1)单核细胞经人参皂苷Rg3联合细胞因子诱导均产生了不同比率的具有树突状细胞形态学特征的DC.这些细胞表达DC的表面分化抗原,能刺激产生MLR反应.(2)Rg3(5.0 μg/ml)联合细胞因子(GM-CSF 150 ng/ml,IL-4 50 ng/ml,TNF-α 40 ng/ml)使单核细胞-DC获得率(以CD80、CD86双阳性定义DC)由43.31%提高到59.75%,并提高了DC刺激淋巴细胞的增殖能力.结论 人参皂苷Rg3联合细胞因子可以将正常人单核细胞体外诱导成为形态、表型和功能符合DC特征的细胞,可使单核细胞诱导DC产率增加,并提高其抗原呈递功能.     

脐血树突状细胞的体外培养及免疫学特征

目的　探讨脐血树突状细胞 (DC)的体外诱导及其免疫学特征。方法　无菌条件下常规采集脐血 ,采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞 ,去除悬浮细胞后获得单核细胞。将获得的单核细胞分为两组 ,组 1:在含白介素 4(IL 4 )和粒细胞巨细胞集落刺激因子 (GM CSF)的DMEM液中培养。组 2 :在上述培养液中孵育 5天后 ,加入肿瘤坏死因子 (TNF α)。收集培养 7天的贴壁细胞 ,分别用流式细胞仪检测CD83、CD86 、CD54、CD1α和CD1 4等免疫因子。结果　①组 1培养 12～ 14天树突状细胞数含量约 2 0 %。组 2培养 7～ 10天即可见到明显树突状细胞达 30 %。②TNF α可明显增加干细胞早期增殖能力 ,两组相比P <0 0 5。③IL 4、GM CSF和TNF α可诱导脐血来源的单核细胞 (即DC前体细胞 )分化为成熟的DC ,两组均高表达DC特异性抗原CD83、CD86 、CD54、CD1α。结论　脐血中的DC前体细胞可在体外诱导成为功能性 (即成熟 )DC。GM CSF联合TNF α不仅可以促进细胞形态的生长 ,而且明显增加DC生成数量。故脐血有可能成为DC免疫治疗丰富的来源。     

成人外周血来源的树突状细胞的体外诱导

目的:以外周血单核细胞为前体细胞,建立体外诱导树突状细胞(dendriticcell,DC)的方法。方法:用密度梯度离心法、贴壁法从健康人外周血获取单核细胞,加入IL-4、GM-CSF和TNF-α培养7～9d成为DC,进行细胞形态学、表面标志及混和淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)的鉴定。结果:外周血单核细胞经诱导培养后,具有典型的树突状形态特征,表达高水平的MHC-II类抗原和CD86共刺激分子以及多种表面标志,在MLR中能有效地刺激同种异体的淋巴细胞增殖。结论:外周血单核细胞可以成功地诱导为具有典型形态特征及功能的DC。     

人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外诱导

目的:探讨在体外从人外周血单核细胞诱导培养成熟的树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法:培养过程分两阶段,第一阶段:采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞,再以黏附法分离出单核细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)100 ng/mL、重组人白介素-4(rhIL-4)100 ng/mL体外诱导.第二阶段:第5天加入重组人肿瘤坏死因α-(rhTNF-α)100 ng/mL,继续培养2 d,刺激DC成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪检测DC表面标志物CD83、CD1a、CD86、CD40、CD14表达水平,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果:人外周血单核细胞经rhGM-CSF及rhIL-4诱导培养5 d后,多数细胞呈集落生长,细胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分别是14.3%、12.8%、20.1%、19.9%及16.2%.加入rhTNF-α诱导后,即培养第7天,细胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分别是29.8%、18.2%、33.6%、28.1%及8.0%(与第5天比较,均P<0.05).成熟后的DC具备较强刺激T细胞增殖的能力.结论:rhGM-CSF联合rhlL-4诱导人外周血单核细胞,可获得大量不成熟的DC,该体系有利于Dc扩增,加入rhTNF-α,继续培养2 d,可诱导出成熟的DC,成熟的DC具备较强刺激T细胞增殖的能力.     

科研新闻速递

血单核细胞早期凋亡可能是脓毒症时机体的保护机制单核细胞激活在脓毒症级联反应的启动中起关键作用。最近希腊科研人员对脓毒症患者血单核细胞凋亡与预后的关系进行了研究。试验纳入了90例呼吸机相关性肺炎导致脓毒症的患者,于脓毒症出现后1、3、5和7d分离血单核细胞,采用荧光素标记双染色法在流式细胞仪上检测细胞凋亡率;此外,用酶免疫法检测内毒素刺激后细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL6)水平,评价单核细胞功能。结果显示:单核细胞凋亡率≤50%患者与>50%患者的病死率分别为49.12%和15.15%(P<0.0001);统计学分析也…     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学观察与功能研究

目的：探讨从人外周血单核细胞体外培养扩增的树突状细胞(dendritic cell,DC)形态学特征及其活性。方法：人外周血常规分离单个核细胞，粘附6h后去除悬浮细胞，以细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)进行诱导培养7d，并进行形态学特征，细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。结果：培养1周即可得到大量DC，形态学观察可见细胞形态不规则，细胞表面大量突起，为典型的DC特征，免疫组化和间接免疫荧光显示CDla阳性表达率达80％～95％，并能刺激同种淋巴细胞增殖反应。结论：人外周血单核细胞可经GM-CSF、IL-4诱导培养成DC，具有典型的树突状细胞的形态学特征及抗原呈递能力。     

自体树突状细胞体外诱导扩增方法的安全性改进

目的 :改进从外周血获得自体树突状细胞的方法的临床安全性。方法 :密度梯度离心法分离鼻咽癌患儿外周血单个核细胞 (PBMC) ,贴壁法获得单核细胞 ,以IL 4、GM CSF、TNF α和人血浆进行诱导扩增树突细胞(DC)并进行表面分子鉴定 ,同时检测其对自体外周血T细胞的刺激作用。结果 :成功培养并扩增出成熟度较高的DC ,平均从每 1mL外周血扩增出的DC数量达到 ( 3 2± 1 1)× 10 5,这些DC具备很强的刺激T细胞增殖的能力。结论 :本法可从外周血扩增大量自体树突状细胞 ,有很强的刺激自体T细胞增殖的活性 ,并增加临床应用的安全性。     

DLBCL患者经GM-CSF治疗后外周血单个核细胞及树突状细胞变化研究

目的研究弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者经GM-CSF治疗后,外周血单核细胞、树突状细胞(DC)、髓系树突状细胞(mDC)以及浆系树突状细胞(pDC)的变化情况。方法 2014年10月至2016年2月入住该院的33例DLBCL患者静脉注射GM-CSF进行治疗,每周注射1次GM-CSF,每周为1个疗程,共治疗3个疗程。每次注射前,静脉采血3mL,采血后24h内用流式细胞仪对外周血单核细胞和DC进行检测。检测结果用SPSS17.0软件进行统计分析。结果 33例患者GM-CSF治疗前单核细胞水平为(9.85±2.31)%,3个疗程治疗后为(3.67±0.78)%,差异有统计学意义(P0.01)。DC水平治疗前为(0.24±0.04)%,治疗后为(0.58±0.13)%,差异有统计学意义(P0.01)。其中,mDC治疗水平为(0.11±0.02)%,低于治疗后的(0.36±0.08)%(P0.01);pDC治疗前、后比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 DLBCL患者经GMCSF治疗3个疗程后,单核细胞明显减少,DC显著增加,其中mDC显著增加,pDC无明显变化,即GM-CSF治疗激活了DLBCL患者的抗肿瘤免疫。     

重组凝血因子Ⅷ轻链Trp1707Ser突变对免疫吞噬作用的影响

目的探索重组凝血因子Ⅷ轻链(r FⅧLC)Trp1707Ser突变对免疫吞噬作用的影响。方法贴壁法收集人外周血CD14+单核细胞,粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)诱导培养树突状细胞(DC),运用流式细胞仪对DC进行免疫分型检测;使用FITC荧光染料标记原核表达获得的野生型和Trp1707Ser突变型r FⅧLC,分别与DC进行孵育吞噬,运用流式细胞仪对蛋白吞噬率进行检测。结果所培养的DC以吞噬能力较强的未成熟DC为主,DC对野生型r FⅧLC的吞噬率为80.1%,对突变型r FⅧLC的吞噬率为78.4%。结论 Trp1707Ser突变对DC免疫吞噬r FⅧLC无明显影响。     

无血清培养基对树突细胞体外诱导的影响

我们比较了无血清培养基X—VIVO 20与有血清培养基(含10％人AB血清或胎牛血清RPMI 1640)对外周血单核细胞来源的树突细胞(DC)体外质导、分化成熟的影响。     

骨髓、脐血干细胞中淋巴细胞和单核细胞与CD34、CD38亚型细胞百分比在治疗肝硬化中的比较

目的 观察骨髓血干细胞和脐带血干细胞在细胞总数中的比例,并分析两者在肝硬化治疗中的作用.方法 50 例肝硬化患者行干细胞移植治疗肝硬化,其中34 例采用自体骨髓干细胞移植治疗,16 例采用脐带血干细胞移植治疗.分析干细胞分离后淋巴细胞和单核细胞的数量及CD34 、CD38 水平.结果 分离后的脐带血淋巴细胞和单核细胞百分比分别为60.56 %和17.93 %,明显多于骨髓血46.75 %和10.70 %.分离后脐血干细胞的CD34 、CD38 明显多于骨髓血干细胞,分别为5.7 ∶1.6 和2.4 ∶1.6.结论 脐带血干细胞所占细胞明显优于骨髓血干细胞中所占细胞的比例,在干细胞治疗肝硬化时,能够提供具有丰富数量及质量的细胞应用于临床.     

IFN-γ激活的树突状细胞对患者急性髓性白血病细胞的杀伤作用

为检测干扰素γ(IFNγ)激活的外周血树突状细胞(DC)对患者急性髓细胞白血病(AML)细胞的直接杀伤活性并探讨其杀伤机制,分离健康供者外周血单核细胞,用重组粒巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导生成DC。于诱导第7天在合成培养液中加入IFNγ继续培养12小时,将其激活。从6例初发的急性髓细胞白血病患者外周血分离单个核细胞作为靶细胞,以不同效靶比与DC共同培养18小时,采用51Cr释放试验检测DC激活前后抗肿瘤活性的差异。同时,用流式细胞术检测DC表面共刺激分子,细胞膜及细胞内Fas配体(FasL)、TNFα及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的改变,以明确IFNγ激活的DC对肿瘤细胞直接杀伤活性的作用机制。结果表明:IFNγ可增强DC对AML细胞的杀伤活性,在效靶比为20∶1时杀伤率为(33.8±1.6)%,与未加刺激因子前相比有显著差异(P<0.05);IFNγ可上调DC表面共刺激分子CD86和CD83的表达;IFNγ刺激后,DC细胞内TRAIL表达明显增强,但其在细胞表面仍呈现低表达,而细胞内及细胞表面FasL及TNFα在IFNγ刺激前后均无明显变化。结论:IFNγ激活的DC可有效杀伤患者AML细胞,其作用机制与DC的成熟及TRAIL凋亡途径部分相关,而与FasL及TNFα凋亡途径无关。     

外周血单核细胞来源树突状细胞体外扩增及诱导抗乳腺癌免疫的研究

目的研究外周血来源树突状细胞(DC)的体外扩增及诱导特异性抗乳腺癌细胞的免疫效应。方法(1)从外周血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(monocyte,Mo)。粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化扩增培养7d后,应用流式细胞术进行表型分析。(2)诱导单核细胞分化的第3天加入人乳腺癌细胞株3A0的冻融抗原培养4d后,获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从外周血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝法检测CTL及上清液对人乳腺癌细胞株3A0、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用。结果(1)外周血来源Mo在GM-GSF和IL-4作用下,第7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)HLA-DR、CD83。(2)DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对乳腺癌细胞3A0有特异性杀伤、抑制作用(P<0.05)。结论外周血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤乳腺癌细胞的免疫效应。     

含癌胚抗原片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞疫苗的体外杀伤作用

目的：观察研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）转染含癌胚抗原（CEA）片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法：抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血，分离单核细胞，体外培养，使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC，诱导特异性T细胞。检测体外培养的DC和CTL活性，并使用MTT法检测细胞毒性T细胞（CTL）对LOVO细胞的杀伤作用。结果：转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86、IL-12，诱导的细胞毒性T细胞高表达IFN-γ；转染后DC诱导特异性细胞毒性T细胞可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论：重组腺相关病毒转染DC，不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能，可诱导自体细胞毒性T细胞增殖，含CEA片断的腺相关病毒转染DC诱导自体细胞毒性T细胞对LOVO细胞有明显杀伤作用，DC疫苗可以作为直肠癌患者免疫治疗的有效补充。     

人巨细胞病毒特异性淋巴细胞的体外活化与增殖

目的:寻找一种安全有效的HCMV特异性淋巴细胞体外活化增殖方法。方法:分离外周血单核细胞,用白介素-4(IL-4)和粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导分化为未成熟树突细胞,流式细胞仪检测表面特征标志;从AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)提取HCMV抗原,以未成熟树突细胞作抗原呈递细胞,共同刺激自体淋巴细胞的活化增殖,2d后检测TNF-α的分泌;继续刺激12d后,收获淋巴细胞作为效应细胞,以吞噬HCMV抗原的自体树突细胞作靶细胞,检测被杀伤细胞LDH的释放,估计其特异性细胞毒功能。结果:①单核细胞经IL-4和GM-CSF刺激4d分化为未成熟树突细胞,高表达CD1a(87.5%);低表达CD14(4.2%)、CD83(48.4%)、CD86(45.8%)和HLA-DR(55.4%)。②HCMV感染者的淋巴细胞经自体未成熟DC和HCMV抗原诱导2d后,细胞因子TNF-α的分泌显著增加(P<0.05)。③继续诱导12d后,部分淋巴细胞转化为HCMV特异性细胞毒T细胞,能特异性杀伤靶细胞(P<0.01)。结论:IL-4和GM-CSF可有效地促使HCMV感染者单核细胞转化为树突细胞,这些细胞能有效呈提HCMV抗原至自身淋巴细胞(HCMV感染者),并使其活化增殖。这为HCMV感染的免疫预防和治疗进一步提供了依据。     

IL-10对培养的树突状细胞影响的研究

目的:探讨IL-10对培养的树突状细胞的影响。方法：采用Ficoll—Hypaque淋巴细胞分离液从正常人外周血分离PBMC，以细胞贴壁法分离得单核细胞。在RPMI 1640培养液中加入rhGM—CSF和rhIL-4诱生树突状细胞(DC)，分别在培养第8，第13d时加入0，12．5，25，50，100ng／ml浓度梯度的IL-10。作用2d后，用倒置相差显微镜或荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞术分析DC表型。结果：IL-10对成熟DC的表型表达无影响；IL-10抑制未成熟DC的共刺激分子CD86和DC成熟特异标志CDla，CD83的表达，对CD80的表达没有影响；对未成熟DC的Ⅱ类抗原HLA—DR的表达率无影响，但使其表达的平均荧光强度降低；IL-10能使未成熟的DC向耐受原性抗原提呈细胞(APC)转化。结论：为过敏性疾病和自身免疫性疾病的预防和治疗提供了实验依据。     

人脐静脉内皮细胞抑制单核细胞源树突状细胞的产生

本研究旨在探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对树突状细胞(DC)发育的影响.首先,利用酶消化法从人脐带分离获得HUVEC,从细胞形态、表型和功能进行鉴定;进一步将获得的HUVEC结合细胞因子配伍与CD14+单核细胞共培养,检测HUVEC对CD14+细胞向DC分化的影响;流式细胞术检测分化细胞的表型,混合淋巴细胞反应检测分化细胞的免疫学功能;采用中和抗体实验和Western blot检测对细胞增殖和分化起重要调控作用的IL-6和VEGF以及ERK和p38MAPK通路的改变.结果表明,从脐静脉分离获得的细胞呈长梭形形态,细胞表型为vWF+ CD31+ CD73+CD45-HLA-DR-CD86-CD34low,Dil-Ac-LDL吸收实验为阳性,且细胞可诱导形成血管样结构,提示分离获得了HUVEC;进一步将HUVEC与CD14+单核细胞共培养,流式细胞仪检测结果表明HUVEC可抑制CD14+单核细胞向DC的分化,诱导获得的细胞CD1a表达显著降低,混合淋巴细胞检测结果显示,与HUVEC共培养获得的DC刺激T细胞增殖作用显著降低,且具有剂量依赖性;中和抗体实验分析其可能的作用机制表明,IL-6和VEGF在CD14+单核细胞向DC分化过程中具有重要调控作用,Western blot检测结果说明其主要通过ERK和p38通路完成调控作用.结论:人内皮细胞参与DC的发育,且起到抑制作用.

Abstract：

This study was aimed to investigate the effect of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)on dendritic cell(DC)development.First,HUVEC were isolated from human umbilical cord by collagenase digestion,and then the morphology,immunophenotypes and functions were identified.Furthermore,the HUVEC were cocultured with CD14+ monocytes under the cytokine condition for detecting the influence of HUVEC on differentiation of CD14+ cells to DC.The phenotype of dendritic cells derived from CD14+ cells was analyzed by flow cytometry,the immunoregulatory function of DC was tested by mixed lymphocyte reaction(MLR).The change of IL-6 and VEGF as well as EPK and p38 signal pathway were analyzed by neutral antibody experiment and Western blot.The results showed that HUVEC isolated from human umbilical cord were characterized by spindle-shaped morphology,homogenous immunophenotypes (vWF+ CD31+ CD73+ CD45-HLA-DR-CD86-CD34(low),Dil-Ac-LDL incorporation ability and forming capillary-like structures.Following stimulation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)plus interleukin-4 (IL-4),HUVEC cocultures could inhibit the initial differentiation of CD14+ monocyte to DC.Interestingly,IL-6 and VEGF enhanced the suppression effect of HUVEC on generation of DC via activation of the ERK or p38 mitogen activated protein kinase pathway.It is concluded that HUVEC are involved in DC development and can suppress the differentiation of monocyte to DC.     

韦格纳肉芽肿患者外周血免疫细胞TLR_4的表达

目的检测韦格纳肉芽肿(WG)患者外周血免疫细胞特别是树突状细胞(DC)上Toll样受体4(TLR4)的表达有无异常。方法流式细胞仪检测正常人及WG患者外周血免疫细胞表面TLR4蛋白的表达。结果 TLR4在WG患者外周血中性粒细胞(PMN)、单核细胞、BDCA3+DC、CD11c+DC和DC样单核细胞-CD14+CD16+单核细胞上的表达与正常人无显著差异,但在淋巴细胞上的表达显著高于正常人;活动期与非活动期患者、环磷酰胺和甲氨蝶呤治疗组患者TLR4的表达无显著差异。结论 TLR4在WG患者外周血DC、DC样单核细胞及免疫细胞的表达无明显异常。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

CD14高表达单核细胞系白血病细胞体外诱导培养树突细胞及其免疫功能研究

树突细胞(DC)作为一种功能最强的抗原呈递细胞，具有很强的激发初始T细胞(naive T cell)应答能力。利用细胞因子组合将白血病细胞分化为DC或DC样细胞，对克服白血病细胞的免疫逃避机制，逆转机体的免疫耐受，诱导特异抗白血病免疫等具有重要意义。但由于白血病细胞所属系列及分化程度的异质性，存在多方面的缺陷，并不能从所有的白血病细胞中成功诱导出DC。正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中CD14^ 胞可以在GM-CSF IL-4的诱导下分化为CD1α^ CD14^-的DC，称单核细胞衍生的DC(Mo-DC)，我们推测高表达CD14的单核系白血病(包括M4、M5)细胞是否同样可在该细胞因子组合作用下诱生出单核系白血病细胞来源的树突细胞(Mo-LDC)。我们选择CD14高表达的M4、M5患分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，比较在GM-CSF TNF-α或GM-CSF IL-4 TNF-α组合作用下，CD14^ 黏附细胞与CD14^-的非黏附细胞向DC分化的能力。