皮肤鳞状细胞癌皮损和细胞系中Patched-1及Gli-1表达的检测

目的探讨Hedgehog信号传导通路中Pathched-1(Ptch-1)和Gli-1在鳞状细胞癌皮损和细胞系中的表达情况及其意义。方法采用免疫组化技术分别检测鳞状细胞癌皮损和细胞系A431、HSQ-89、HSC-2及Tca中Hedgehog信号通路的Ptch-1及Gli-1的蛋白水平的表达与分布。结果Ptch-1及Gli-1在鳞癌皮损、细胞系A431、HSQ-89以及HSC-2细胞中均有阳性表达,主要分布在鳞癌细胞胞膜及胞浆中。结论鳞癌皮损和细胞系中Ptch-1及Gli-1的阳性表达可能通过激活Hedgehog信号传导通路,促进鳞状细胞癌的形成和发展。     

皮肤鳞状细胞癌中Patched-1和Gli-1蛋白检测及mRNA表达的研究

目的探讨Hedgehog信号转导通路在皮肤鳞状细胞癌皮损中的激活水平及状态。方法采用免疫组化和原位杂交方法检测皮肤鳞状细胞癌皮损及正常皮肤中Hedgehog信号通路的Patched-1和Gli-1的蛋白水平及mRNA的表达和分布。结果Patched-1和Gli-1蛋白及mRNA检测呈明显阳性着色,主要分布于鳞癌细胞胞浆中。结论鳞癌皮损中Hedgehog信号转导通路处于激活状态。     

Patched-1和Gli-1在银屑病皮损中的表达

目的 探讨Patched-1、Gli-1在银屑病皮损中的表达。方法 应用免疫组化和原位杂交的方法,检测银屑病皮损及正常人皮肤中Patched-1、Gli-1的表达和分布情况。结果 在银屑病皮损中Patched-1表达高于正常人皮肤(免疫组化χ²=6.53,P<0.05;原位杂交χ²=7.93,P<0.05),Gli-1表达显著高于正常人皮肤(免疫组化χ²=19.21,P<0.01;原位杂交χ²=14.34,P<0.01),主要分布于表皮细胞胞浆中,在毛囊、浸润的炎细胞及血管内皮细胞中也有阳性表达。结论 银屑病皮损表皮中Patched-1和Gli-1均处于高表达状态,Hedgehog信号转导通路可能在银屑病发病中起一定作用。     

特异性抑制Hedgehog信号通路对鳞状细胞癌Tca细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨特异性抑制Hedgehog信号通路对人鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法用Hedgehog信号通路的特异性抑制剂KAAD-cyclopamine处理Tca细胞,采用MTT法观察KAAD-cyclopamine对Tca细胞增殖的影响,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期的变化,凋亡率检测使用Annexin-V-FITC/PI双染法,细胞周期采用PI染色法。结果随着KAAD-cyclopamine作用时间的延长及浓度的增加,其对Tca细胞增殖的抑制作用增强(F=25.39,P<0.01)。流式细胞仪检测显示:随着KAAD-cyclopamine浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加(F=43.67,P<0.01);细胞周期表现为G2/M期阻滞。结论KAAD-cyclopamine通过下调Hedgehog信号通路的活性,抑制人鳞状细胞癌Tca细胞增殖并促进其凋亡,诱导细胞发生G2/M期阻滞为其可能机制之一。     

COX-2在皮肤鳞状细胞癌中的检测

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)在皮肤鳞状细胞癌中的水平及与增殖指标K i67的关系。方法应用免疫组化SP染色法对57例皮肤鳞状细胞癌皮损及20例正常皮肤组织石蜡切片进行COX-2,K i67染色,在光镜下观察并计数其阳性细胞。结果①COX-2与K i67在正常皮肤组织中均无阳性染色,在皮肤鳞状细胞癌皮损中染色强度显著增高(P<0.05);②分化程度不同的皮肤鳞状细胞癌皮损中COX-2蛋白强弱差异无显著性(P=0.756),而K i67有显著性差异(P<0.01);③COX-2与K i67在皮肤鳞状细胞癌皮损中的水平呈显著正相关(r=0.767,P=0.05)。结论在皮肤鳞状细胞癌中COX-2,K i67表达异常增高,二者呈正相关;过度表达的COX-2蛋白可能参与肿瘤细胞的增殖过程。     

银屑病及几种皮肤肿瘤皮损中PI3K的表达

目的 探讨PI3K亚单位P85及P110与银屑病发病的相关性。方法 采用免疫组化法检测寻常性银屑病、慢性湿疹、脂溢性角化、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌皮损和正常人皮肤中P85和P110的表达，对免疫染色的强度进行吸光度测定，统计学处理采用方差分析。结果 上述各组表皮中，P85的表达差异无统计学意义，FP85 = 0.21，P > 0.05；P110的表达差异有统计学意义，FP110 = 35.64，P < 0.01。与各组比较，银屑病皮损表皮P110的表达均明显升高，差异均有统计学意义，其余各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。各组皮损的浸润淋巴细胞中P85和P110的表达差异均有统计学意义，FP85 = 59.98，P < 0.01；FP110 = 323.23，P < 0.01；鳞状细胞癌组及银屑病组分别与其余各组比较，差异均有统计学意义；银屑病与鳞状细胞癌组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 P110表达的增强可能与角质形成细胞的增殖过速密切相关；而P110和P85的高表达是否与银屑病皮损内淋巴细胞的活化及增殖有关尚需进一步的研究。     

皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中Smad7、Smurf1和Smurf2的表达

目的 探讨Smad7、Smurf1和Smurf2在基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中表达水平的变化及其意义。方法 采用实时定量聚合酶链反应和免疫组化技术分别检测基底细胞癌、鳞状细胞癌及正常人对照皮肤中Smad7、Smurf1和Smurf2的表达。结果 Smad7、Smurf1和Smurf2在基底细胞癌和鳞状细胞癌中的表达较正常表皮显著升高。结论 基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中Smad7、Smurf1和Smurf2的表达增强可能干扰转化生长因子β（TGFβ）信号转导通路的多个环节，使TGFβ抑制上皮增生的作用不能有效发挥，从而有助于上述表皮肿瘤的异常增殖。     

KAAD-环巴胺抑制Hedgehog信号通路对人鳞状细胞癌细胞株A431生长及凋亡的影响

目的 探讨Hedgehog信号转导通路的特异性抑制剂KAAD-环巴胺对人鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用 MTT 法测定KAAD-环巴胺对A431细胞的增殖抑制情况，光镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测KAAD-环巴胺对A431细胞周期的影响，用 Annexin-V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率的变化。结果 MTT 结果显示0.5，1，2，5 μmol/L KAAD-环巴胺对A431细胞的生长抑制率依次为（7.0 ± 2.3）%，（20.6 ± 2.8）%，（48.3 ± 3.4）%和（61.6 ± 3.3）%，F = 49.92，P ＜ 0.01；5 μmol/L KAAD-环巴胺作用1 ～ 5 d 的生长抑制率分别为（18.3 ± 2.6）%，（56.1 ± 3.7）%，（65.4 ± 2.8）%，（71.2 ± 1.9）%，（75.9 ± 3.0）%，F = 16.32，P ＜ 0.01，表明KAAD-环巴胺可显著抑制A431细胞增殖，且呈浓度和时间依赖性：r浓度 = 0.91，P ＜ 0.01；r时间 = 0.86，P ＜ 0.05。光镜下细胞形态明显受损。细胞周期结果显示KAAD-环巴胺作用组G1期细胞数为（76.2 ± 1.8）%，较空白对照（51.8 ± 2.9）%明显增加，F = 26.34，P ＜ 0.01，G1期前亚二倍体峰由空白对照组（1.7 ± 0.3）%增至（8.7 ± 0.2）%，F = 6.32，P ＜ 0.05，表明 KAAD-环巴胺可以将A431阻滞于G1期。凋亡检测结果显示KAAD-环巴胺可以明显诱导A431细胞发生凋亡，凋亡率由空白对照（18.5 ± 3.1）% 增至（46.2 ± 2.8）%，F = 32.01，P ＜ 0.01。阴性对照组实验结果与空白对照组比较差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。结论 Hedgehog信号通路的特异性抑制剂KAAD-环巴胺能够显著抑制A431细胞增殖并诱导其凋亡。     

PTEN在银屑病和皮肤非黑色素肿瘤中的表达和意义

目的探讨PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)与银屑病角质形成细胞(KC)增殖的关系,以及PTEN在炎症增生性疾病与皮肤恶性肿瘤中的作用机制。方法采用免疫组化法检测19例寻常性银屑病皮损、18例健康人正常皮肤、20例慢性湿疹、20例脂溢性角化症、20例基底细胞癌、20例皮肤鳞状细胞癌患者PTEN的表达。并利用计算机图像采集与分析系统对免疫组化结果进行平均光密度测定,统计学处理采用t检验。结果各组PTEN着色的平均光密度值在正常人为0.659±0.120、银屑病0.078±0.052、慢性湿疹0.711±0.162、脂溢性角化0.694±0.055、基底细胞癌0.704±0.165、皮肤鳞状细胞癌0.036±0.132。银屑病皮损、皮肤鳞状细胞癌PTEN着色的平均光密度值均低于正常皮损,三者之间相比差异均有统计学意义,其中皮肤鳞状细胞癌平均光密度值低于银屑病皮损。慢性湿疹、脂溢性角化和皮肤基底细胞癌中PTEN着色的光密度值高于正常皮肤,四者之间相比差异均无统计学意义。结论银屑病皮损中PTEN过低表达可能导致银屑病PI3K/Akt信号传导通路异常活化,引起KC过度增殖和异常凋亡,参与银屑病发病。     

神经生长因子及受体在非黑素性皮肤癌中的表达

目的：探讨神经生长因子（NGF）及受体P75在非黑素性皮肤癌中的表达情况。方法：用原位杂交的方法对15例鳞状细胞癌（SCC）、12例基底细胞癌（BCC）、13例正常上皮（NS）中NGF及受体P75 mRNA进行了检测。结果：与正常皮肤组织比较,NGF mRNA在基底细胞癌组织中的表达明显增高（t=30.06,P〈0.01）,在鳞状细胞癌组织中的表达明显下降（t=19.62,P〈0.01）,鳞状细胞癌组织与基底细胞癌组织相比差异有统计学意义（t=57.36,P〈0.01）。P75mRNA在皮肤正常组、基底细胞癌组、鳞状细胞癌组中的表达呈逐渐降低趋势,组与组之间两两比较差异均有统计学意义：鳞状细胞癌组与正常皮肤组（t=42.69,P〈0.01）,基底细胞癌组与正常皮肤组（t=30.37,P〈0.05）,鳞状细胞癌组与基底细胞癌组（t=18.49,P〈0.05）。结论：NGF及受体P75可能在非黑素性皮肤癌发生及浸润中起一定作用。     

COX-2抑制剂NS398对人鳞状细胞癌Tca8113细胞株生长和凋亡的影响

目的 探讨COX-2抑制剂NS398对鳞状细胞癌细胞Tca8113生长及凋亡的影响。方法 细胞培养加入NS398作用后,采用噻唑蓝（MTT） 法观察NS398 对Tca8113细胞增殖的影响,流式细胞仪及透射电镜研究NS398对Tca8113细胞周期和凋亡的作用。结果 MTT比色法显示NS398能抑制Tca8113细胞的生长,呈浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测结果显示NS398干预细胞出现典型的亚二倍体"凋亡峰";G0 /G1期细胞比例升高,S期和G2 /M期比例下降。电镜下见典型的凋亡形态学改变。结论COX-2抑制剂NS398在体外可通过诱导凋亡有效抑制Tca8113细胞的生长。     

内皮素1对人A375黑素瘤细胞株细胞黏附及细胞黏附分子1表达的影响

目的 探讨内皮素（ET）－1对人A375黑素瘤细胞增殖、黏附、迁移及细胞黏附分子（ICAM）－1表达的影响。方法 MTT法观察ET－1对人A375黑素瘤细胞生长的影响,黏附实验检测细胞黏附,Transwell迁移系统检测细胞迁移,流式细胞仪检测对人A375黑素瘤细胞ICAM－1表达的影响。结果 ET-1在0.002 ～ 0.2 μg/mL浓度范围可促进黑素瘤细胞的增殖、在纤连蛋白上的黏附、通过微孔滤膜及抑制ICAM－1的表达（P < 0.01）,在0.2 μg/mL时作用最强,细胞代谢活性（24 h）、细胞黏附率、ICAM-1含量（24 h）分别为0.327 ± 0.009、163.31 ± 4.05、4.667 ± 0.551;在0.2 ～ 2 μg/mL浓度范围作用相反。结论 ET-1可能通过抑制ICAM-1的表达、促进细胞增殖、黏附及迁移而增强细胞代谢、增加色素形成。     

齐墩果酸对体外培养人毛囊干细胞增殖的影响

目的:探究齐墩果酸对人毛囊干细胞增殖活性的影响。方法:取术中毁弃的人全层头皮标本,使用两步酶消化法分离提取毛囊干细胞进行体外培养,运用免疫荧光K15染色鉴定;将细胞以5×10~4个/mL的密度接种于96孔板,培养液中分别加入1×10~(-4)、1×10~(-3)、1×10~(-2)、0.1、1μg/mL梯度浓度齐墩果酸,于处理的24 h及48 h使用MTT法检测毛囊干细胞活性。结果:获得的毛囊干细胞呈典型的铺路石状生长,免疫荧光K15阳性,阳性率为(86.7±5.2)%(n=4)。与空白组相比,1×10~(-4)μg/mL及1×10~(-3)μg/mL齐墩果酸处理组在24 h及48 h的OD_(490)均有明显升高(P<0.05)。结论:齐墩果酸能够促进体外培养的人毛囊干细胞增殖。     

甲磺酸伊马替尼对人黑素瘤细胞c-KIT表达的影响

目的:探讨甲磺酸伊马替尼对体外培养的人黑素瘤细胞系c-KIT表达及增殖的影响.方法:采用免疫组化和Western 印迹法检测人黑素瘤M14细胞和鼠黑索瘤B16F10细胞中c-KIT的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析3种浓度(5、10、20μmol/L)甲磺酸伊马替尼对M14细胞和B16F10细胞的生长抑制作用,Western印迹法观察M14细胞c-KIT和p-c-KIT蛋白的表达情况.结果:M14细胞存在c-KIT表达,B16F10细胞未见表达.3种浓度甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞的增殖,导致其形态改变:10、20μmol/L甲磺酸伊马替尼均能抑制B16F10细胞的增生,5μmol/L甲磺酸伊马替尼对其无影响.不同浓度甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞p-c-KIT蛋白的表达,但对c-KIT蛋白无影响.结论:甲磺酸伊马替尼能抑制M14细胞的增殖,机制可能与抑制c-KIT的磷酸化有关.     

他扎罗汀诱导前后角质形成细胞TIG 3 mRNA表达

目的研究他扎罗汀对培养的正常人角质形成细胞增殖和他扎罗汀诱导基因3(TIG3)mRNA表达的影响。方法用0.1和1.0μmol/L他扎罗汀处理正常人角质形成细胞24h后,用MTT法、RT-PCR和实时定量RT-PCR(TaqMan探针)法分别检测细胞增殖和TIG3mRNA表达的改变。结果他扎罗汀可抑制角质形成的增殖和诱导TIG3mRNA的表达。0.1和1.0μmol/L他扎罗汀处理角质形成细胞后,分别使角质形成细胞增殖抑制5.0%和11.1%,使TIG3mRNA增加到正常对照组的2.1倍和2.8倍。结论他扎罗汀可抑制角质形成细胞的增殖和上调TIG3mRNA的表达。     

甘草次酸抑制表皮细胞生长因子对HaCaT细胞促增殖作用的机制研究

目的 探讨甘草次酸对表皮细胞生长因子（EGF）诱导的HaCaT细胞增殖的影响,并对其可能机制进行相关研究。方法 MTT法检测不同浓度EGF （0、1、5、10、25、50、100 ?滋g/L） 以及不同浓度甘草次酸（0、0.1、1、10、25、50、100 ?滋mol/L）对HaCaT细胞增殖的影响,25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L MEK1/2抑制剂 （U0126） 对25 ?滋g/L EGF促HaCaT细胞增殖的抑制作用。蛋白免疫印迹法检测25 ?滋g/L EGF对ERK1/2磷酸化的促进作用,25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L U0126对ERK1/2磷酸化的抑制作用,25 ?滋g/L EGF、25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L U0126分别或同时作用下HaCaT细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、Notch-1蛋白的表达情况。使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行t检验、方差分析和相关分析。结果 EGF在0 ～ 100 ?滋g/L范围内促进HaCaT细胞增殖（r = 0.798,P ＜ 0.05）,在0 ～ 50 ?滋g/L 范围内与HaCaT细胞增殖呈线性相关（r = 0.859,P ＜ 0.05）。甘草次酸在10 ～ 100 ?滋mol/L范围内浓度依赖性地抑制HaCaT细胞增殖（r = －0.945,P ＜ 0.01）;25 ?滋mol/L甘草次酸明显抑制25 ?滋g/L EGF对HaCaT细胞的促增殖作用以及对ERK1/2的促磷酸化作用。同时,25 ?滋mol/L甘草次酸、10 ?滋mol/L U0126均抑制25 ?滋g/L EGF对HaCaT细胞PCNA、Notch-1蛋白的促表达作用。结论 甘草次酸可抑制EGF对HaCaT细胞的促增殖作用,其机制可能与甘草次酸抑制EGF对HaCaT细胞ERK1/2信号通路的激活有关。     

罗格列酮对人黑素瘤细胞株A375体外侵袭能力的抑制及相关机制

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法 体外培养人黑素瘤细胞株A375;噻唑蓝法（MTT）检测罗格列酮对A375细胞的增殖抑制率;RT-PCR、Western印迹检测罗格列酮对黑素瘤侵袭相关基因基质金属蛋白酶2（MMP2）、组织金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）表达的影响。Matrigel侵袭实验检测罗格列酮对黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响。结果 MTT结果显示,在24 h干预点,罗格列酮浓度为10、25 μmol/L 时,对A375细胞增殖抑制率分别为（4.86 ± 0.31）%、（5.15 ± 0.52）%,细胞毒性作用不明显。罗格列酮能在mRNA和蛋白水平下调MMP2的表达（P < 0.01）,并上调TIMP2 mRNA的表达（P < 0.01）。侵袭实验显示,对照组、10 μmol/L罗格列酮组、25 μmol/L罗格列酮组穿过Transwell小室膜的A375细胞数依次为210.7 ± 14.9,154.1 ± 7.7,87.3 ± 8.1,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 罗格列酮能抑制人黑素瘤细胞株A375的转移,可能与其下调MMP2的表达有关。     

腺苷对人毛囊生长的促进作用及对血管生成素表达的影响

目的：探讨腺苷对人毛囊生长的促进作用及对血管生成素表达的影响。方法分离完整的人头皮生长期毛囊,分成6组,分别加入0、0.1、1、10、100、1000μmol/L腺苷作用,每个浓度组再分成两个亚组,其中一个亚组加入0.8 mg/L抗人血管生成素抗体,另外一个亚组不加抗体,显微镜下测量6 d内毛囊的生长长度。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,分组同上,作用48 h后,噻唑蓝法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录（RT）?PCR和ELISA分别检测人毛乳头细胞血管生成素mRNA和细胞上清液中血管生成素蛋白的表达。结果与不加腺苷的对照组相比,10~1000μmol/L腺苷能够明显促进体外培养的人毛囊生长（F=377.776,P<0.05）,其中以100μmol/L腺苷的促进作用最为显著（P<0.05）,加入抗人血管生成素抗体能够部分拮抗腺苷促进人毛囊生长的作用。与对照组相比,0.1~1000μmol/L腺苷能够明显促进体外培养的人毛乳头细胞增殖（F=230.067,P<0.05）,其中以10μmol/L和100μmol/L腺苷促进细胞增殖的作用最为显著（均P<0.05）,加入抗人血管生成素抗体能够部分拮抗腺苷促进细胞增殖的作用。流式细胞仪检测显示,与对照组相比,10~1000μmol/L腺苷能够显著下调毛乳头细胞G1期细胞比例（F=75.5,P<0.05）,并显著上调G2期（F=15.7,P<0.05）和S期（F=81.8,P<0.05）细胞比例。而且,与对照组相比,10μmol/L和100μmol/L腺苷能够明显促进毛乳头细胞表达血管生成素mRNA（F=942.630,P<0.05）和血管生成素蛋白（F=148.544,P<0.05）。结论腺苷在体外具有促进人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的作用,其机制可能与上调血管生成素表达有关。