基于重组优势多表位抗原的梅毒间接酶联免疫吸附试验与梅毒螺旋体血凝试验和甲苯胺红不加热血清试验检测梅毒螺旋体抗体的比较研究

目的：建立操作简便、特异性好、敏感性高的血清梅毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法：通过计算机分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位，构建了梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)表达载体，转化宿主菌HB101进行表达，纯化获得高纯度融合抗原。在此基础上，以纯化抗原包被酶联板，建立检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法。利用该方法与梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）和甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）同时检测了126例梅毒可疑血清样本，对检测结果进行了比较研究。结果：梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原（rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)在大肠杆菌中获得了高效表达，并成功建立了检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法及试剂。对126例梅毒可疑血清样本的检测结果，ELISA、TRUST、TPHA的检出阳性率分别为75．40％（95／126）、72．22％（91／126）、70．63％（89／126）， 其中TRUST有29例，TPHA有6例为可疑阳性。TPHA检测的6例可疑阳性中，有5例ELISA、TURST均为阳性；而TRUST测出的29例可疑样品中，仅7例ELISA、TPHA阳性。结论：多表位嵌合抗原ELISA试剂在特异性、敏感性与TPHA法相近，但明显优于TRUST法。     

梅毒螺旋体优势表位抗原嵌合表达构建双抗原夹心法的研究

目的用基因工程方法表达嵌合的梅毒螺旋体优势表位抗原,建立检测血清梅毒抗体的双抗原夹心酶联免疫方法(double antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-EIA)。方法通过计算机软件分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位,用聚合酶链式反应(PCR)扩增优势表位基因,构建了梅毒螺旋体多优势表位嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN47)表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)进行表达,亲和层析柱法纯化获得高纯度融合抗原,并用其建立检测梅毒抗体的DAS-EIA。结果表达的优势表位嵌合抗原具有很好的抗原性。用其建立的嵌合抗原DAS-EIA检测确诊的50份阳性和30份阴性血,阳性检出率和阴性检出率都是100%。结论嵌合抗原DAS-EIA法具有比间接EIA和重组单抗原DAS-EIA更高的灵敏度和检出正确率,其检测水平已经达到国外TPHA的水平。该方法的建立为临床检测梅毒开辟了新的方法。     

基于重组优势多表位抗原的梅毒间接酶联免疫吸附试验与梅毒螺旋体血凝试验和甲苯胺红不加热血清试验检测梅毒螺旋体抗体的比较研究

目的 建立操作简便、特异性好、敏感性高的血清梅毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。方法 通过计算机分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位,构建了梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)表达载体,转化宿主菌HB101进行表达,纯化获得高纯度融合抗原。在此基础上,以纯化抗原包被酶联板,建立检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法。利用该方法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测了126例梅毒可疑血清样本,对检测结果进行了比较研究。结果 梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)在大肠杆菌中获得了高效表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法及试剂。对126例梅毒可疑血清样本的检测结果,ELISA、TRUST、TPHA的检出阳性率分别为75.40％(95/126)、72.22％(91/126)、70.63％(89/126),其中TRUST有29例,TPHA有6例为可疑阳性。TPHA检测的6例可疑阳性中,有5例ELISA、TRUST均为阳性;而TRUST测出的29例可疑样品中,仅7例ELISA、TPHA阳性。结论 多表位嵌合抗原ELISA试剂在特异性、敏感性与TPHA法相近,但明显优于TRUST法。     

螺旋体传染病

基于重组优势多表位抗原的梅毒间接酶联免疫吸附试验与梅毒螺旋体血凝试验和甲苯胺红不加热血清试验检测梅毒螺旋体抗体的比较研究——张贺秋等(北京中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所100850)；《中国性病艾滋病防治&;gt;，2002，8(5)：266—268[目的：建立操     

梅毒螺旋体重组抗原TmpA的表达及其在梅毒诊断中的应用

目的：用基因工程方法表达梅毒螺旋体的TmpA重组抗原,建立检测梅毒螺旋体抗体酶联免疫试验（EIA）。方法：用聚合酶链反应（PCR）扩增梅毒螺旋体TmpA基因,克隆到原核表达载体pQE-30中表达,用亲和层析柱法纯化该重组抗原,并用其建立检测梅毒螺旋体抗体的EIA。结果：表达的重组抗原相对分子质量构为39000,具有良好的抗原性。用其建立的EIA检测10份阳性参比血清,均为阳性,灵敏度为100%;检测20份阴性参比血清,均为阴性,特异性为100%。检测12份I期梅毒（早期感染）和24份Ⅱ期和晚期梅毒患者血清,阳性率分别为91.67%（11/12）和100%（24/24）。结论：用该重组抗原建立的EIA可检出97.2%（35/36）以上梅毒患者,仅2.8%（1/36）漏检。为进一步提高该试剂的灵敏度,可能需增加梅毒螺旋体的其它重组抗原。     

戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的　建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法　将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果　建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论　利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。     

梅毒螺旋体Tp0453特异性抗原优势表位区段的克隆表达及其在血清学诊断中的初步评价

目的 应用基因工程技术在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp) Tp0453(62～224位氨基酸)重组蛋白,为提高梅毒血清学诊断试剂的特异性提供实验基础.方法 采用PCR法从Tp全基因组中扩增目的片段Tp0453(第184～672位核苷酸),T-A克隆后构建原核表达质粒pQE30-Tp0453,酶切鉴定后转化E.coli M15,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达,Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白,表达产物经Western印迹鉴定其免疫反应性.以纯化的重组抗原建立双抗原夹心法ELISA,检测经Tp抗体明胶颗粒凝集试验(TPPA)法确证的梅毒阳性血清48份、阴性血清40份.结果 PCR法扩增出约490 bp目的片段,成功构建原核表达质粒pQE30-Tp0453,并在E.coli M15中表达,蛋白表达率为18％,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定目的蛋白的相对分子质量为21 000,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度＞95％,Western印迹证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应.双抗原夹心法ELISA检测88份临床标本,灵敏度为97.9％(47/48),特异度为100.0％(40/40),与TPPA的总符合率为98.9％(87/88).结论 所表达的Tp0453重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒提供了实验基础.     

戊型肝炎病毒抗体双原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的 建立抗戊型肝炎病毒（HEV）抗体检测的双抗原夹心ELISA（DS-ELISA），并应用于多种动物血清的检测。方法 将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物醇（HRP）标记。利用5份阳性血清和40份阴性血清建立双抗原夹心ELISA；用400份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况；用3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂；用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛，绵羊，山羊，猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果 建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法，对400份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好，并且有更高的s/co比较；与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早，尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂；在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体，其中猪抗体的阳性率最高，表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论 利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA，并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。     

螺旋体传染病

梅毒螺旋体嵌合抗原的克隆表达及其临床应用；梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究；钩端螺旋体疫苗鉴别试验及其国家参考品的建立；中国莱姆病螺旋体PD91重组外膜蛋白A的动物免疫效果分析；两种检测梅毒螺旋体抗体方法的比较；重庆市钩端螺旋体病流行因素监测分析。[编按]     

芯片法筛选钩端螺旋体外膜蛋白抗原表位

目的 通过芯片法筛选钩端螺旋体主要外膜蛋白中抗原表位,为后续研制有广泛交叉保护作用的通用钩体疫苗提供科学依据。方法 采用PCR及测序法检测主要外膜蛋白编码基因在不同血清群钩体中的分布情况及其序列相似性。采用生物信息学软件预测钩体外膜蛋白抗原表位。采用抗体纯化磁珠试剂盒纯化大鼠抗不同血清群钩体抗血清IgG。采用抗原芯片法检测各抗原肽的免疫反应性,确定优势抗原表位。结果 候选抗原蛋白编码基因均广泛存在于不同血清群的致病性钩体中且序列保守。综合生物信息学软件结果预测出30个候选T-B联合抗原表位。合成短肽结合芯片检测方法共筛选出9个优势抗原表位,各抗原肽对不同血清群钩体抗血清IgG反应性基本一致。结论 芯片法可高效筛选钩体外膜蛋白优势表位,为表位肽疫苗的研制提供支持。     

梅毒螺旋体TprF蛋白B细胞表位的预测与鉴定

目的 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) 膜蛋白TprF氨基端保守区(TprF^N)的优势B细胞表位,为深入研究梅毒多价表位疫苗提供依据。方法 从GenBank获取TprF^N的氨基酸序列,采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测TprF^N的B细胞表位并人工合成多肽;表达重组蛋白TprF^N并经Western blot鉴定后免疫兔,获取血清并测定抗体效价;以TprF^N免疫兔血清、梅毒患者血清(设正常人血清和正常兔血清为阴性对照),间接ELISA测定预测的7条人工合成的B细胞表位多肽的免疫反应性和特异性。结果 软件综合预测TprF^N的P1 (43-62AA)、P2(57-71AA)、P3(81-88AA)、P4(89-103AA)、P5(125-138AA)、P6(231-251AA)、P7(268-279AA)可能为B细胞表位;表达一可溶性蛋白,WB鉴定为目的 蛋白,其免疫抗体效价为1∶12 800以上;ELISA结果显示,预测表位P1、P3与TprF^N免疫兔血清及梅毒患者血清均呈阳性反应,而与对照血清均不反应。结论 P1、P3为TprF潜在的优势B细胞表位。     

布氏杆菌表面特异性多表位抗原的串联表达与免疫磁珠的初步建立

目的为获得布氏杆菌表面多表位抗原的特异性抗体,用于布氏杆菌免疫磁珠的构建。方法 从布氏杆菌3个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段并插入原核表达载体,转化至E. coli BL21(DE3),获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,IPTG诱导后表达出30 kDa的重组蛋白,亲和层析纯化后将其进行Western blot分析、间接ELISA鉴定和兔免疫试验,制备的抗血清经亲和层析纯化后,包被成免疫磁珠并用于布氏杆菌富集。结果 表达的重组蛋白能与牛抗布氏杆菌血清反应,其抗血清与布氏杆菌发生良好反应,纯化抗体包被的免疫磁珠能特异性吸附布氏杆菌。结论 获得的布氏杆菌特异性抗体和免疫磁珠具有良好的应用前景。     

伯氏疏螺旋体与苍白密螺旋体、钩端螺旋体的免疫交叉反应抗原研究

目的研究莱姆病螺旋体与梅毒、钩端螺旋体较常出现的交叉反应抗原，明确产生交叉反应的蛋白抗原成分，为精确蛋白免疫印迹法检测莱姆病的阳性判断标准提供参考依据。方法以中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因型代表菌株PD91作抗原，用蛋白免疫印迹法对梅毒病人和钩端螺旋体病人的血清进行抗体(IgG和IgM)检测。结果共检测梅毒病人血清196份和钩端螺旋体病人血清68份。伯氏疏螺旋体与苍白密螺旋体抗原在75kDa，60kDa，43kDa，41kDa处有交叉，交叉反应阳性率分别为IgG：8．2％、20．4％、9．2％、17．3％，IgM：7．7％、10．2％、8．7％、9．7％；伯氏疏螺旋体与钩端螺旋体抗原的交叉发生在75kDa，60kDa，41kDa，交叉反应阳性率分别为IgG：1．5％、1．5％和13．2％，IgM：8．8％、2．9％、17．6％。结论莱姆病螺旋体蛋白抗原中75kDa，60kDa，43kDa和41kDa蛋白成分与梅毒和钩端螺旋体存在交叉反应。     

三种实验室检测方法对梅毒诊断的临床意义分析

目的检验三种梅毒实验室检测方法的梅毒阳性检出率,分析各检测指标间的相互关系,探讨其临床意义。方法抽取性病门诊就诊者的静脉血,用梅毒酶联免疫吸附试验(ELISA)检测梅毒抗体,同时用梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)检测同一份血清,二种方法均为阳性者用荧光梅毒螺旋体抗体吸收法(FTA-ABS)检测及免疫印迹法(WB)确认,对试验数据进行统计分析和检查。结果在所有784名性病门诊就诊者中,ELISA检测梅毒抗体阳性者306人,阳性率39.03%;TPPA法检测梅毒抗体阳性为297人,阳性率为37.88%;经FTA-ABS检测确证阳性299人,阳性率为38.14%;最终WB结果与FTA-ABS检测一致。结论为了提高梅毒的检出率及正确性,对高度疑似梅毒的患者,应同时进行两种抗体的检查。     

螺旋体传染病：伯氏疏螺旋体与苍白密螺旋体、钩端螺旋体的免疫交叉反应抗原研究

目的：研究莱姆病螺旋体与梅毒、钩端螺旋体较常出现的交叉反应抗原，明确产生交叉反应的蛋白抗原成分，为精确蛋白免疫印迹法检测莱姆病的阳性判断标准提供参考依据。方法：以中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因型代表菌株PD91作抗原，用蛋白免疫印迹法对梅毒病人和钩端螺旋体病人的血清进行抗体（IgG和IgM）检测。结果：     

酶联免疫吸附试验检测梅毒患者血清中抗苍白螺旋体IgM抗体

目的评价抗苍白螺旋体IgM抗体检测对梅毒的临床意义.方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)对72例梅毒患者检测了特异性IgM抗体,并与快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)的检测结果进行比较分析.结果血清抗苍白螺旋体IgM抗体在一期梅毒的阳性率为73.3%(11/15),在二期梅毒的阳性率为88.9%(16/18),二者差异无显著的统计学意义(χ2＝1.6363,P＞0.10).在潜伏梅毒,IgM抗体阳性率为26.1%(6/23),非常显著地低于早期显性梅毒(χ2＝17.6189,P＜0.005).在一期、二期和潜伏梅毒,RPR和TPPA的阳性率均为100%.入组前2～24个月已经正规抗梅治疗的梅毒16例,其中IgM抗体阳性2例.结论 ELISA法检测特异性IgM抗体诊断一期梅毒并不优于RPR和TPPA.IgM抗体在潜伏梅毒敏感性低,其诊断应依靠RPR和TPPA.目前不推荐单独检测抗梅毒IgM抗体来监测病情和判断疗效.抗苍白螺旋体IgM抗体的临床意义有待更深入的研究.     

基于OMP18的B细胞抗原表位的空肠弯曲菌ELISA检测方法的建立

目的 以OMP18的B细胞抗原表位多肽为包被抗原,建立检测空肠弯曲菌感染的ELISA方法。方法 以不同浓度梯度(0.1,1,10 μg/mL)OMP18的B细胞抗原表位多肽进行包被,以空肠弯曲菌全菌兔抗IgG为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体IgG为二抗,检测对原浓度1 mg/mL的不同稀释度(1:10,1:100,1:1 000)抗体IgG水平。分别以空肠弯曲菌感染兔血清、健康兔血清及沙门菌感染兔血清为一抗,1:3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,比较各抗原表位多肽的免疫特异性。结果 OMP18的B细胞抗原3个表位多肽在稀释度在1:1 000、1:4 000、1:16 000、1:64 000时免疫反应性均有明显增高。其中稀释度在1:1 000时增高最明显。OMP18的B细胞抗原表位多肽具有免疫特异性。结论 用OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原对空肠弯曲菌感染的血清进行ELISA检测,免疫反应性高,具有免疫特异性。     

螺旋体传染病

问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR的克隆及原核表达系统的构建； 浙江省首次在蜱中检测到莱姆病螺旋体DNA片段；梅毒螺旋体不同血清学检验方法的应用评价；梅毒螺旋体明胶颗粒凝集法改良微板技术的建立及应用；牙周基础治疗对龈下菌斑中螺旋体及牙周状态影响的研究；梅毒螺旋体特异性IgM抗体检测的临床评价；     

建立双抗原夹心酶免疫试验对人畜布鲁氏菌抗体检测的研究

目的为人畜布鲁氏菌病(布病)的血清学诊断、监测及流行病学调查提供特异、敏感、快速的试验方法。方法在制备高滴度的布鲁氏菌(布氏菌)抗原及其抗原辣根过氧化物酶结合物基础上。建立了检测人畜布氏菌抗体的双抗原夹心酶免疫试验(DAgS-EIA),包括常规双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)、双抗原夹心酶免疫斑点试验(DAgS-DIEA)以及快速双抗原夹心ELISA(快速DAgS-ELISA),并对影响本试验的主要因素因素进行了试验。结果制备了高滴度的布氏菌抗原及其抗原酶结合物和冻干制品。并在此基础上,建立了常规DAgS-ELISA及DAgS-DIEA以及快速DAgS-ELISA检测人畜布氏菌抗体方法。经对115份布病患者血清检测结果,阳性率以DAgS-ELISA为最高(61.7%),其余依次为RBPT(58.1%)I、-ELISA(55.6%)、DAgS-DIEA(53.7%)、及SAT(44.2%)且用DAgS-EIA检测布氏菌感染羊、牛、猪及实验动物家兔、豚鼠和小鼠均为强阳性反应,而对正常人、羊、牛、猪及实验动物血清均为阴性反应。结论双抗原夹心酶免疫试验检测人畜血清布氏菌抗体,不仅特异、敏感、快速、简便而且仅需制备单一的布氏菌抗原酶结合物就可对人及各类动物血清布氏菌抗体进行检测。     

螺旋体传染病

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立和初步临床应用；钩端螺旋体病患的临床观察及护理；梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定；重组钩端螺旋体外膜蛋白酶联免疫吸附（ELISA）检测方法的建立；问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR的克隆及原核表达系统的构建；浙江省首次在蜱中检测到莱姆病螺旋体DNA片段。[编按]