肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

胰腺癌病人外周血树突状细胞体外扩增及表型检测

胰腺癌 (pancreaticcarcinoma,PC)是常见的消化道恶性肿瘤之一 ,早期诊断率和手术切除率均较低。胰腺癌细胞对放化疗不敏感 ,以往的生物免疫治疗很不满意 ,因而胰腺癌的治疗十分棘手 ,预后十分恶劣 ,被列为二十一世纪医学顽固堡垒 ,所以 ,以提高胰腺癌总体疗效为目的规范化综合治疗成为当前研究的重要课题。树突状细胞(dendriticcells,DC)在综合治疗中显得特别重要 ,已知DC是人体内最具潜能的抗原提呈细胞 ,能提呈抗原给MHC Ⅰ (classⅠmajorhistocompatibilitycomplex ,MHC Ⅰ )类限制性CD8+ T淋巴细胞和MHC Ⅱ (classⅡmajorhisto…     

树突状细胞的体外扩增和抗肿瘤免疫

树突状细胞（DC）是体内最重要的抗原提呈细胞,具有独特的免疫学功能,综述了DC分离,体外扩增,鉴定和功能检测方法的研究现状,分析了DC与肿瘤免疫的关系,以及DC抗肿瘤治疗的应用前景。     

树突状细胞的体外扩增和抗肿瘤免疫

树突状细胞 (DC)是体内最重要的抗原提呈细胞 ,具有独特的免疫学功能。综述了DC分离、体外扩增、鉴定和功能检测方法的研究现状 ,分析了DC与肿瘤免疫的关系 ,以及DC抗肿瘤治疗的应用前景     

人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法

目的:建立稳定、高效的人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC)体外培养的新方法。方法:离心获取人外周血白膜层细胞,裂解去除红细胞后获得全部白细胞,贴壁培养1 h获得单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 U/ml 重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500 U/ml,体外培养7 d获得DC,以流式细胞术分析表型,体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能。结果:从100 ml全血分离获得具有较好活力的贴壁单核细胞仅需2 h;部分肿瘤患者应用传统分离方法不能获得单个核细胞,用新方法仍能从患者外周血稳定地获得足够数量的单核细胞。新方法培养生成DC的数量为传统方法培养生成DC数量的1.8~2.6倍;其中40%~85%为CD1a ,表达高水平的HLA-DR、CD80、CD86,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖。结论:建立了更为稳定的、得率更高的DC体外扩增培养的新方法。     

人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定

目的：建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法：方法：从正常人外周血F1细胞分离单个核细胞，经三种细胞因子——重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rh GM—CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)和重组人肿瘤坏死因子(rh TNFα)联合诱导培养，10天后收获细胞，利用光学显微镜、透射电镜观察其外部形态和细胞超做结构，流式细胞仪检测其细胞表面抗原，自体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的增殖活性：结果：培养收获了高纯度的DC，这些细胞表面有大量的不规则突起，核也呈不规则状，核仁小，核膜异染色质聚集，含有丰富的细胞器，如核糖体、内质网、溶酶体等；细胞表面高水平表达HLA—DR、CD1α、CD80、CD83和CD86；自体混合淋巴细胞反应表明诱导所得的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单个核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟DC。     

宫颈癌患者外周血树突状细胞抗宫颈癌免疫反应

[目的]研究自宫颈癌患者外周血分离、培养而来的树突状细胞体外对宫颈癌Hela细胞的抑制作用.[方法]应用细胞因子诱导培养从宫颈癌患者外周血分离的单核细胞,获得成熟DC.宫颈癌组织来源抗原致敏DC,激活T细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL).MTT法检测比较负载抗原DC与未负载抗原DC诱导的CTL对Hela细胞和SKOV3细胞不同的杀伤效应.[结果]宫颈癌细胞抗原致敏的DC,激活肿瘤抗原特异性CTL,对宫颈癌Hela细胞产生高效而特异的杀伤作用(56.410%),对卵巢癌SKOV3细胞仅有一定的杀伤作用(24.901%);而未致敏DC激活的CTL对以上两种肿瘤细胞只有很低的杀伤作用,分别为10.256%和20.151%.单纯肿瘤抗原刺激下的T细胞,对Hela和SKOV3细胞产生非特异性杀伤作用,其效率仅为1.865%及15.613%.[结论]宫颈癌患者外周血DC在体外能诱导高效而特异的抗宫颈癌细胞免疫反应,提示肿瘤抗原激活的DC作为疫苗在宫颈癌的免疫治疗中具有重要意义.     

人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

肾癌患者自体树突状细胞的体外诱导和扩增

目的 体外诱导和扩增肾癌患者自体树突状细胞.方法 采用密度梯度离心法,从肾癌患者外周血单核细胞中诱导树突状细胞,用rhGM-CSF和rhIL-4刺激活化,倒置显微镜观察细胞形态.结果 从肾癌患者外周血中成功诱导树突状细胞.镜下观察为典型的树突状细胞形成特征.结论 从肾癌患者外周血中可诱导和扩增树突状细胞,为以DC为基础的肿瘤疫苗在肾癌中的应用打下基础.     

树突状细胞体外诱导分化扩增方法的研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种重要的免疫辅佐细胞,是体内最广泛的专职抗原递呈细胞(profession-alantigen presenting cells),具有强大的激活静息T细胞,激发初次免疫应答的独特功效,在肿瘤免疫治疗中,具有潜在的应用价值.     

树突状细胞提呈凋亡癌细胞抗原的实验研究

目的：建立从人外周血诱导扩增树突状细胞（ＤＣ）及吞噬凋亡小体负载抗原。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞,加入５０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ,１０００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ－４,隔天一次,共４次,培养第三天,加入γ射线照射过的胆管癌细胞,再继续体外培养一周后,用树突细胞富集柱收集ＤＣ。结果：见ＤＣ高表达共刺激分子Ｂ７和ＣＤ１ａ,表面具有典型不规划突起,ＤＣ还可捕捉凋亡小体、吞噬凋亡小体。负载抗原     

造血干细胞诱导树突状细胞的临床应用

目的:探讨回输自动员人外周造血干细胞(PBSC)体外诱导树突状细胞(DCs)治疗乳腺癌患者的可行性.方法:采用CS-3000血细胞分离系统分离9例粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预动员乳腺癌患者PBSC,在体外经rhGM-CSF、rhIL-4诱导和自体肿瘤细胞提取物刺激后成为成熟DCs,收集并自体回输.用MTT法测定DCs在体内外激活细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性.结果:9例患者平均采集1.02×109PBSC,培养后平均收获2.3×108DCs,CD83表达率平均为68.7%.收获DCs的数量是等量未动员全血的57.5倍.在体外自体肿瘤抗原致敏的DCs激活CTL对自体原代培养的肿瘤细胞具有显著的杀伤活性.DC瘤苗自体回输除轻微发烧外,无任何其它不良反应,回输后患者PBMC对自体肿瘤细胞的杀伤活性提高20倍.结论:用血细胞分离机分离G-CSF动员肿瘤患者PBSC,在体外诱导制备自体DC瘤苗,回输治疗可提高对自体肿瘤细胞的杀伤活性,而且安全可靠,无明显不良反应.     

乳腺癌患者外周血、淋巴结、癌组织中免疫细胞构成分析

目的分析乳腺癌患者外周血、淋巴结、癌组织免疫细胞构成。方法20例健康志愿者及40例乳腺癌患者外周血、18例乳腺癌患者反应性增生淋巴结及40例乳腺癌肿瘤组织细胞悬液用于流式细胞术检测,分析其单个核细胞群中CD₃⁺、CD₄⁺、CD₈⁺、CD₁₉⁺、CD₅₆⁺细胞百分比及CD₃₄^-Lin^- HLA-DR⁺细胞群中细胞CD_11c⁺ CD₁₂₃^- (pDC₁）、CD_11c^-CD₁₂₃⁺( pDC₂）百分比,计算 CD₄/CD₈比值以及DC₁/DC₂比值。结果乳腺癌患者外周血CD₃⁺、CD₄⁺、CD₈⁺、CD₁₉⁺、CD₅₆⁺细胞百分比、CD₄/CD₈比值与对照组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）,pDC₁/pDC₂比值显著低于对照组（P<0.05）;反应性增生淋巴结组织亚群构成为：CD₃⁺（54.5±6.8）%、CD₄⁺（37.8±4.9）%、CD₈⁺（13.1±5.5）%、CD₁₉⁺（5.9±3.4）%、CD₅₆⁺（1.9±0.4）%、CD₄/CD₈为（3.6±1.3）,DC₁/DC₂为（3.6±1.3）%。无法取得正常组织中的值,未作对照分析。瘤组织中CD₃⁺（62.4±17.5）%、CD₄⁺ （32.0±8.2）%、CD₈⁺（26.9±10.5）%、CD₄/CD₈（1.3±0.4）、CD₁₉⁺（2.2±2.0）%、CD₅₆⁺（2.3±1.6）%,DC数不足以分析。结论乳腺癌患者外周血、淋巴结、肿瘤组织中免疫细胞构成,与对照组比较表现为抗肿瘤特征,循环中pDC₁/pDC₂比值减低可能与DC₁在引流淋巴结中分布增加有关。     

钙载体A_(23187)快速诱导人外周血单核细胞成树突状细胞

 目的　探讨钙载体 (calciumionophore ,CI)A2 3 187对正常人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)形态、表面分子表达及免疫功能的影响。方法　分离健康献血者外周血单核细胞 ,分别加入 :重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0ng/ml、rhGM CSF 10 0ng/ml +IL 4 5 0ng/ml、rhGM CSF +A2 3 187(钙载体 ,CI)各 10 0ng/ml。体外培养 4 0h后 ,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志、MTT比色法检测上述细胞对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果　外周血单核细胞在GM CSF +A2 3 187各 10 0ng/ml的条件下培养 4 0h ,就可看到典型的DC形态 ,其表面单核细胞的特征性标志CD14分子表达减少 ,HLA DR、CD80、CD86及CD83分子的表达均明显增高 ,且具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论　外周血单核细胞在钙载体A2 3 187及GM CSF的共同作用下 ,4 0h就能获得成熟的DC     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。     

巢式RT-PCR检胃癌患者外周血循环癌细胞的研究

目的　分析胃癌患者外周血中CK 2 0mRNA及CEAmRNA的异常表达及意义。方法　采用RT PCR方法检测 5 2例胃癌患者术前外周血中CK 2 0mRNA及CEAmRNA的表达。结果　胃癌患者外周血中CK 2 0mRNA、CEAmRNA阳性表达率分别为 42 .3 % (2 2 /5 2 )及 5 1.9% (2 7/5 2 ) ,CK 2 0mRNA和CEAmRNA两者中至少 1个基因为阳性的表达率为 63 .5 % (3 3 /5 2 )。胃癌患者外周血中CK 2 0mRNA表达与胃癌的远处转移有关 ,CEAmRNA表达、CK 2 0mRNA和CEAmRNA都表达、CK 2 0mR NA和CEAmRNA两者中至少 1个表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移和远处转移相关 (P <0 .0 5 )。结论　胃癌患者外周血CK 2 0和CEA的RT PCR检测有助于患者预后的判断 ;联合检测CK 2 0mRNA和CEAmRNA可增加外周血循环癌细胞检测的敏感性     

Analysis of a Chronic Myelogenous Leukemia Patient Vaccinated with Leukemic Dendritic Cells Following Autologous Peripheral Blood Stem Cell Transplantation

Dendritic cells (DCs) are believed to be the most potent antigen-presenting cells and may be important in the induction of anti-leukemia specific T cell responses. In this preliminary clinical study, a patient with chronic phase chronic myelogenous leukemia (CML) was vaccinated with autologous leukemic DCs following autologous peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT). In an in vitro study, leukemic DCs were generated using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor-α, and interleukin-4 from granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)-mobilized PBSC fraction of this patient, and were found to be Phl⁺, and to possess the morphologic and phenotypic characteristics of mature DCs. These cells could also elicit antigen-specific immune responses, including a vigorous cytotoxicity specific to CML cells. In the clinical experiment, we obtained evidence that infused leukemic DCs could induce T cell clones expressing the same T cell receptor usage as a cytotoxic T cell line, suggesting that the immune repertoire includes tumor-reactive T cells. These cytotoxic T lymphocytes are activated in vivo . The vaccination of leukemic DC caused a decrease in the number of Phl⁺ cells in the peripheral blood and bone marrow. These results indicate that the activity is an immunologically mediated phenomenon and vaccination therapy with leukemic DC following autologous PBSCT may be effective in treating CML.