鼠拟胚体来源细胞向肝细胞及心肌细胞分化的初步观察

目的观察微重力生物反应器内拟胚体（EBs）的形成及其EBs来源细胞的肝细胞与心肌细胞分化。方法将未分化鼠胚胎干细胞（Es细胞）以1×10^6／mL移人微重力反应器内旋转培养，6d后取出反应器内形成的EBs接种于培养板培养，使用含DMSO、地塞米松等IMDM培养液继续培养10d。动态观察EBs形成和EBs来源细胞分化细胞形态特征，采用Western blot、免疫荧光染色方法检测EBs来源细胞肝细胞及心肌细胞标志物的表达。结果生物反应器旋转培养6d形成均一的拟胚体，接种后移行细胞中出现肝细胞特征样细胞和自发性搏动细胞，Western blot检测到EBs来源细胞肝细胞标志物Alb表达，免疫荧光染色分别检测出肝细胞标志物Alb、AFP和心肌细胞标志物GATA4的表达。结论微重力生物反应器可加快EBs的形成。EBs来源细胞可有效地向肝细胞及心肌细胞分化，两种细胞之间可能存在相互作用。     

曲古菌素A联合细胞因子体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞

目的:建立细胞因子和曲古菌素A(trichostatin A,TSA)联合诱导小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向肝细胞分化的3步法.方法:ESC在含激活素A的不含白血病抑制因子的培液中培养3 d分化为定形内胚层细胞;然后加入酸性成纤维细胞生长因子和T S A联合诱导5 d,再加入肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)等诱导因子培养5 d,向肝细胞方向分化,最后以致瘤素M、地塞米松继续培养5 d形成成熟肝细胞.自发分化组做阴性对照组不加上述因子,不含白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的培养液进行自发分化培养.结果:诱导分化18 d后,用光镜、免疫荧光、RT-PCR检测显示诱导18 d后,出现了大量类肝脏细胞表型的上皮细胞,RT-PCR检测显示这些细胞表达成体肝脏细胞特异标记如酪氨酸转氨酶、白蛋白(albumin,ALB)、天冬氨酸转氨酶、甲状腺激素结合蛋白等.细胞免疫荧光也显示为甲胎蛋白、ALB、细胞角蛋白18阳性,分化细胞具有成熟肝脏细胞所具有的糖原储存、吲哚菁绿摄取和释放功能.其分化效率用ALB阳性率表示,诱导分化率可达57.38%.结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合细胞因子体外诱导ESC可以成功分化为肝细胞,从而为体外获得大量肝细胞对肝病的临床细胞移植治疗及其研究提供理论和实践基础.     

含淤胆血清的培养体系体外诱导胚胎干细胞表达肝细胞功能的研究

目的探讨病理微环境体外诱导对小鼠胚胎干细胞(ESC)表达肝细胞功能的作用。方法悬滴培养ESC发育5～7d的拟胚体，将其离散细胞种植于不同的分化体系，观察ESC在自主分化、肝细胞生长因子(HGF)或5％淤胆血清 HGF诱导下每天的分化情况(倒置相差显微镜)，以及细胞的糖原、甘油三酯、白蛋白及尿素氮合成功能，细胞吲哚氰绿(ICG)和荧光二乙酯(FDA)染色的情况。结果ESC自主分化难以控制，分化为3个胚层的细胞。HGF促进ESC向内脏内胚层和中胚层(心肌)分化，但两者仅能表达低水平的肝细胞特异性功能。引入淤胆血清的HGF诱导体系中ESC能分化为较为均一的多角形细胞，具有较高水平的糖原、甘油三酯、白蛋白和尿素氮合成能力，ICG和FDA染色阳性。结论自主分化和HGF诱导ESC表达肝细胞代谢的能力有限。体外模拟病理性微环境可诱导ESC定向分化为肝系细胞，并具有较高水平的肝细胞代谢功能。     

体外定向诱导E14小鼠胚胎干细胞为肝细胞

目的探索体外定向诱导胚胎干细胞分化为肝细胞。方法常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后，进行悬滴-悬浮培养，形成胚胎体，再进行分阶段定向诱导，在培养第9～12天、第12～18人以及第15～18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析持异性基因mRNA的表达，并用吲哚氰绿(ICG)摄取和过碘酸雪夫反应(PAS)分析细胞的分化及功能。结果在诱导培养的第13天，细胞出现肝细胞样改变。RTPCR分析可见，在诱导的第6天和第12天分别可以榆测到内胚层或卵黄囊分化标志基因-甲状腺素运载蛋白和α1抗胰蛋白酶的mRNA表达，第6天出现末成熟肝细胞标志基因-甲胎蛋白mRNA表达，第9天、第15天和第18天分别开始出现成熟肝细胞的特异性标志基因-白蛋白、葡萄糖6磷酸酶、酪氨酸氨基转移酶mRNA表达。同时，ESC源性肝细胞表现为ICG摄取和PAS反应阳性，经过诱导，ICG阳性细胞数约占85．1％。结论ESC源性肝细胞具备肝细胞特性，FSC有可能成为肝细胞治疗的替代供体细胞。     

胚胎干细胞用于肝组织工程研究的初步评价

目的在生物材料上进行胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESc）的三维培养和肝细胞定向诱导分化,评价其用于构建肝组织工程的可行性。方法胰酶消化生物反应器悬浮旋转培养5天的拟胚体（embryoid bodies,EBs）,将细胞悬液与细胞外基质Matrigel 1∶1混合接种于聚乳酸（poly-L-lactic acid,PLLA）和聚乙醇酸（polyglycolic acid,PGA）共聚合三维支架内,用系列诱导剂定向诱导肝细胞分化。镜下动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用HE染色、糖原染色、免疫荧光染色检测组织结构形态、肝细胞功能及其肝细胞标志物白蛋白（ALB）的表达。结果显微镜和扫描电镜见ESc可在聚合支架材料上三维立体状态生长,随培养时间不断增殖,交织成网状。HE染色提示形成了致密的类肝组织样结构。糖原染色和免疫荧光染色结果提示形成的类肝组织表达Alb,并有大量糖原存在。结论可在PLLA/PGA三维支架材料及Matrigel上培养ESc和定向肝细胞诱导分化,长时间培养后可形成类肝样组织。     

小鼠胚胎干细胞诱导为肝细胞的研究

胚胎干细胞(ES细胞)是从体外受精胚囊的内细胞团分离建立的、具有发育全能性的细胞系，在特定条件下可向多种细胞分化，是细胞移植治疗很有前途的细胞来源。目的：探明ES细胞是否能被诱导分化为肝细胞，并探索小鼠ES细胞诱导分化为肝细胞的分化条件。方法：在ES细胞培养液中分别加入肝细胞生长因子(HGF)、β-神经细胞生长因子(NGF)和维甲酸(BA)以及与小鼠胎肝细胞共培养，观察分化细胞的形态学变化，逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测白蛋白和转甲状腺蛋白mRNA水平的表达，免疫组化法检测甲胎蛋白和α1—抗胰蛋白酶蛋白水平的表达。结果：ES细胞培养液中加入HGF和β-NGFl5天后，分化出较多的上皮样细胞，并检测出白蛋白、转甲状腺蛋白mRNA水平的表达和甲胎蛋白、αl-抗胰蛋白酶蛋白水平的表达，表明ES细胞已诱导分化为肝细胞。ES细胞与胎肝细胞共培养2天后，分化出单一形态的上皮细胞，同样有上述肝细胞标志物的阳性表达。RA诱导出的细胞除转甲状腺蛋白mRNA外，无其他肝细胞标志物的阳性表达。结论：在HGF和β—NGF的作用下，有部分小鼠ES细胞被诱导为肝细胞，RA则无此作用。共培养方法也能诱导出肝细胞标志物阳性的细胞，并且细胞形态较单一。小鼠ES细胞有向肝细胞分化的潜能。     

ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究

目的 探索用生物材料三维培养胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)并向肝细胞分化的可行性.方法 胰酶消化悬滴法形成5 d的鼠拟胚胎,将1×106/mL鼠ES细胞与细胞外基质MatrigelTM1:1混合接种于聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)共聚合三维支架内,用DMSO、地塞米松、HGF、FGF4、胰岛素等诱导ES细胞向肝细胞分化,动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用RT-PCR、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)的表达.结果 立体显微镜见ES细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长,并保持细胞活力,随培养时间延长不断增殖.RT-PCR检出分化细胞表达ALB mRNA和AFP mRNA,同样免疫荧光染色也证实表达ALB和AFP.结论 ES细胞可在生物材料聚合三维可降解支架及MatrigelTM上生长,并在诱导剂的作用下向肝细胞分化.     

骨髓间充质干细胞来源类肝细胞的功能和超微结构评估

目的　对骨髓间充质干细胞 (MMSCs)来源的类肝细胞进行功能和超微结构评估。方法　从人胎儿骨髓中分离MMSCs ,在 1%基质胶 (Matrigel)作基质 ,2 .5 μmol/ml氮胞苷 (AZA)预处理10～ 12h ,肝细胞生长因子 (HGF) 10ng/ml 成纤维细胞生长因子 4 (FGF4 ) 10ng/ml 肝细胞生长培养基 (HGM )中培养和诱导。以未诱导的MMSCs作对照 ,对诱导 4d、7d、14d、2 1d、2 8dMMSCs采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测培养上清液中人白蛋白 (ALB)水平 ,脲酶法检测合成尿素的能力 ,过碘酸希夫试验进行糖原染色 ,电镜观察细胞超微结构。结果　在分化过程的不同时相点检测ALB和尿素生成 ,未诱导分化的MMSCs没有分泌ALB和产生尿素 ,而给予FGF4和HGF处理后 ,MMSCs以时间依赖方式产生ALB和尿素。用过碘酸希夫 (PAS)染色法分析发现MMSCs诱导 14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物 ,2 8d后阳性染色细胞数量增多 ,提示诱导后MMSCs已具备肝细胞的糖原合成能力。电镜显示未诱导MMSCs具有幼稚细胞的结构特点。诱导 2 8d的MM SCs已分化 ,并具有上皮样细胞的极性结构特点。结论　诱导后MMSCs已具备肝细胞特有的结构和功能性特征。     

不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导类肝细胞的影响

目的:探讨实验性大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、诱导的最优条件,为MSCs治疗临床重症肝病患者提供参考依据.方法:采用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠MSCs.经培养传代获得纯化的MSCs.采用析因实验,设不同诱导时间、不同浓度的FBS、不同浓度的细胞因子为3个因素,每个因素设不同水平,对纯化的MSCs进行分组诱导培养.留取15、2l、27 d细胞培养液进行白蛋白(A1b)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d时收集细胞爬片,采用过碘酸希夫(PAs)实验进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18和CK-19.结果:诱导15、21、27 d,各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),21 d诱导组AFP水平最高:15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义,21、27d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),27 d诱导组白蛋白水平最高.27d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18、CK-19均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18、CK-19均阴性.多因素方差分析表明,Mscs体外最佳诱导条件为含200mL/LFBS的DMEM 肝细胞生长因子(HGF)20Ug/L 成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)20UG/L.结论:HGF和FGF-4可在体外诱导实验性大鼠Mscs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:不同浓度的FBS、HGF和FGF-4影响MSCs的体外分化;MSCs可作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源.     

肝细胞条件培养液对人脂肪问充质干细胞向肝细胞分化和增殖的作用

目的 探讨人脂肪间充质干细胞在改良的诱导体系下向肝细胞的分化和增殖情况,为肝组织工程提供新的种子细胞来源.方法 从人脂肪组织分离出脂肪间充质干细胞,用含有碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的肝细胞诱导液进行诱导,并于诱导7 d后加入抑瘤素M.用细胞计数试剂盒-8法检测整个诱导过程细胞的增殖情况;通过光学显微镜观察诱导细胞的形态变化;用RT-PCR法和免疫荧光法分别检测肝细胞特异性基因和蛋白的表达;并对多种肝细胞特异性功能进行检测.组间比较采用t-test检验.结果 用改良肝细胞诱导液培养的人脂肪间充质干细胞在培养第5、7、14、21天时,细胞数均明显多于用对照培养液培养的细胞(f值分别为6.59、8.69、15.94和24.64,P值均＜0.05).诱导细胞表现出上皮样肝细胞形态,表达肝细胞特异性基因和蛋白;具有多种肝细胞特异性功能,如靛青绿摄取/排泌、糖原合成以及白蛋白分泌功能.结论 人脂肪间充质干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和抑瘤索M的诱导体系中能够分化为更加成熟的具有多种肝细胞特异性功能的细胞,且此诱导体系同时具有促进细胞增殖的作用.