3.0倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建3.0倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体,稳定转染HepG2细胞,建立HBV感染的细胞模型.方法:从pUC19-3HBV载体上将约9.6kb的3.0倍HBV全基因克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和HindⅢ位点,将构建的pcDNA3-3HBV以脂质体转染HepG2肝癌细胞,经G418稳定筛选.ELISA检测转染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达.RT-PCR检测转染细胞中HBpreS2、HBX的表达.结果:成功构建了3.0倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染HepG2后,建立了新的肝癌细胞系HepG2.3Z,其培养上清中可检测到HBsAg、HBeAg的稳定表达,并可检测到HBpreS2、HBX RNA在转染细胞中表达.结论:构建的3.0倍HBV全基因真核表达载体可介导病毒复制,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型.     

表达小鼠B7-1基因的重组逆转录病毒载体构建及真核表达

目的：构建表达小鼠B7—1基因的重组逆转录病毒载体并在真核细胞中检测其蛋白表达。方法：PCR法获基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，酶切法鉴定，真核细胞中检测蛋白表达。结果：酶切所得片段与所需相符，在真核细胞中检测到蛋白表达。结论：成功构建重组的逆转录病毒载体，为今后研究奠定了基础。     

中国人Uroplakin Ⅱ基因的克隆及其真核表达载体构建

目的 克隆中国人UroplakinⅡ基因并构建其真核表达载体。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法从1例GⅢ/T_3N_0M_0膀胱移行上皮癌(TCC)标本中扩增UroplakinⅡ全长cDNA后进行核酸序列分析,并构建其真核表达载体;重组子瞬时转染UroplakinⅡ基因缺陷型TCC EJ细胞株72h后,RT-PCR法检测癌细胞UroplakinⅡ表达水平。结果 成功克隆了中国人UroplakinⅡ全长cDNA(555 bp),与国外报道的序列同源性高达100％。真核表达载体pcDNA-UPⅡ转染EJ细胞后,癌细胞UroplakinⅡmRNA水平显著增高(P<0.01)。结论 从中国人TCC组织中克隆出UroplakinⅡ基因,为深入研究UroplakinⅡ基因在TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS1)真核表达载体pcDNA3.1/myc-BRMS1,为研究抑制恶性肿瘤转移的机制奠定基础。方法设计含有HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的一对引物,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人乳腺癌细胞株MCF-7中扩增到BRMS1的cDNA基因片断,经回收、纯化、酶切后,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His( )A上,鉴定正确后并转染人胚肾细胞HEK-293进行Western blot验证其是否表达。结果琼脂糖凝胶电泳及基因测序证实重组的pcDNA3.1/myc-BRMS1cDNA的碱基组成与GenBank中的人BRMS1cDNA的基因片断组成相同。结论成功构建了乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体并测序鉴定。     

HSPb1真核表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中表达的研究

目的:构建重组人HSPb1真核表达载体质粒,为研究HSPb1与乳腺癌发生和化疗耐药的关系做准备。方法:从人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计引物调取目的基因片段,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH-5α,筛选菌落并抽提质粒。测序正确后双酶切克隆进入真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1-HSPb1。用pcDNA3.1-HSPb1转染人乳腺癌细胞MDA-MA-231,RT-PCR法和Western blot法鉴定重组质粒在其中的表达。结果:经酶切证实重组质粒pcDNA3.1-HSPb1含有目的基因HSPb1。RT-PCR和Western blot检测表明,mRNA和蛋白水平,转染细胞HSPb1的表达均明显增强。结论:pcDNA3.1-HSPb1真核表达载体构建成功,它在乳腺癌细胞中可高表达目的基因,为进一步研究HSPb1在乳腺癌发生及化疗耐药中的作用奠定了基础。     

小鼠睾丸组织Bmi1基因的克隆及原核表达

目的:克隆小鼠Bm i1 cDNA并进行原核表达,为下一步制备BM I1多克隆抗体奠定基础。方法:从小鼠睾丸组织中克隆Bm i1 cDNA,测序并利用BLAST程序比对证明该基因序列正确后,构建原核表达载体pET-28 c-Bm i1,将其转入大肠埃希菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过免疫印迹检测重组目的蛋白。结果:成功克隆了小鼠Bm i1 cDNA,原核表达的融合蛋白可与H is标签抗体和BM I1单克隆抗体特异性结合。结论:小鼠睾丸组织中Bm i1基因有表达;成功克隆了小鼠Bm i1 cDNA并在大肠埃希菌BL21中正确表达了重组蛋白rBM I1。     

DcR3反义RNA表达载体的构建及表达

目的：构建DcR3反义RNA表达载体PVAXI-as-DeR3，并研究其对肝癌细胞中DcR3蛋白表达的影响。方法：从肝癌组织中提取总RNA，RT-PCR法克隆出DcR3基因片段，将其与PMD18-T载体连接，经BamHⅠ、XholⅠ双酶切TA—DeR3及PVAXⅠ（-）真核表达载体后，使用T4DNA连接酶连接，构建反义DcR3表达载体。转染肝癌细胞株SMMC7721。Western blot法检测DeR3蛋白表达。结果：用RT-PCR方法从肝癌组织中扩增出DcR3片段，并经测序证实。重组质粒经酶切鉴定正确，转染肝癌细胞株SMMC7721后，经Western blot证实DcR3蛋白表达较对照组下降。结论：成功构建反义RNA表达载体PVAXⅠ-as-DcR3，构建的反义表达载体PVAXⅠ—as—DcR3具有阻断DcR3基因表达的效应。     

人VEGF-C基因荧光真核表达载体的构建和表达

目的:构建含有绿色荧光蛋白基因的人血管内皮生长因子C基因的真核表达载体,检测该基因在真核细胞中的表达,研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用.方法:含有绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-1通过末端平滑化,酶切获得5'(粘端)BamHI-EGFP-XbaI(平端)3'片断,已经构建的VEGF-C表达载体pcDNA3.1/VEGF-C通过末端平滑化,酶切获得5'-(粘端)BamHI-pcDNA3.1-目的基因-KpnI(平端)3',两片段连接构建含有绿色荧光蛋白的真核表达载体,琼脂糖凝胶电泳并测序检测插入片段的正确性.将该载体通过脂质体转染到真核细胞CHO中,观察绿色荧光蛋白在CHO细胞中的表达情况.通过G418筛选阳性转染细胞,提取总RNA,行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察VEGF-C基因在CHO细胞中的表达情况.结果:琼脂糖凝胶电泳证实了插入EGFP片段的大小,测序结果证实了插入片段的正确性,CHO细胞中看到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR产物中含有VEGF-C cDNA.结论:成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的VEGF-C真核表达载体并检测到在真核细胞CHO中的表达.     

小鼠睾丸特异性新基因TSAF76的克隆及其在睾丸组织中的表达

目的筛选与精子发生和（或）睾丸发育相关的基因。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA与小鼠睾丸DNA芯片进行杂交，通过杂交信号比较，筛选出差异表达基因。利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR方法分析该基因在小鼠不同组织及不同发育阶段睾丸组织中的表达。结果通过4日龄和18日龄小鼠睾丸芯片信号比较筛选出一个差异表达的基因，命名为TSAF76基因（GenBank登录号：AF503943），测序提示该基因全长1052bp，包含1个474bp的开放阅读框，编码157个氨基酸。对TSAF76蛋白质序列分析表明该蛋白质理论相对分子量为18．77kDa，等电点PI为9．782。TSAF76蛋白与表达于人类睾丸和成熟精子中的AAT1蛋白类似。RT-PCR分析表明TSAF76基因在处于精子发生中的睾丸组织特异性表达。结论TSAF76基因可能在小鼠精子发生过程中起作用。     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

小鼠白细胞介素5真核表达质粒pVAX-1mIL-5的构建及其体外表达

目的构建能表达小鼠白细胞介素5(mIL-5)的质粒并鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以含有mIL-5cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠IL-5基因片段后,定向插入真核表达载体pVAX1中,获得重组表达质粒pVAX1mIL-5。通过双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。采用间接免疫荧光技术检测pVAX1mIL-5在HeLa细胞的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,插入片段正确,间接免疫荧光检测表明其可以在HeLa细胞中瞬时表达。结论构建的真核表达质粒pVAX1mIL-5可以在HeLa细胞中瞬时表达小鼠IL-5的蛋白,为下一步利用IL-5作为DNA疫苗黏膜免疫佐剂研究奠定了基础。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

ER β1基因及其剪切变异体真核表达载体的构建与鉴定

目的应用基因克隆技术构建雌激素受体B1（ERβ1）及其5-8外显子缺失变异体ERβ△5-8（文中简称ERβ△）,为ERβ功能的研究奠定基础。方法组织中提取总RNA,RT—PCR法扩增基因ERp1及ERβ△,限制性酶切并克隆于以带EGFP绿色荧光基因及Myc报告基因的非融合真核细胞表达质粒IRES2-EGFP,菌群转化扩增后琼脂糖凝胶电泳,限制性酶切后行DNA测序鉴定。结果PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明ERβ1长度为1593bp,ERβ△长度为972bp,与GeneBank上公布的蛋白编码区序列一致。结论成功构建ERβ1基因及其剪切变异体ERBA真核表达载体。     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因真核表达载体的构建

目的 构建骨形成蛋白(BMP)-2、转化牛长因子(TCF)-β1双基因真核表达载体.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1两个质粒为模板,分别用引入新的酶切位点引物,PCR扩增出长度为1188 bp的BMP-2和1 173 bp的TGF-β1两个目基因片段;将其分别定向连入真核双基因表达载体plRES;酶切分析及序列测定重组子.结果 双酶切分析电泳可见长度为1188bp的BMP-2条带和1 173 bo的TGF-β1条带,核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-β1构建正确.结论 成功构建了BMP-2及TGF-β1双基因真核表达载体.     

人FHIT基因的克隆及其真核表达质粒的构建

目的克隆人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因,构建其真核表达质粒pRcCMV-FHIT。方法提取人外周血总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术扩增人FHITcDNA全长开放阅读框序列,PCR产物与中间载体pGEM-T连接后转化到大肠杆菌DH5α。然后对单菌落进行菌落PCR、限制性内切酶酶切鉴定和测序。用EcoRI将目的片段切下,插入真核表达载体pRc／CMV2的相应位点,构建表达质粒pRc／CMV2-FHIT,将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR、酶切鉴定。结果测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的FHITcDNA含有781个碱基,与Genbank（NM_002012．1）序列完全一致。pRc／CMV2-FHIT经酶切鉴定与预期结果一致。结论成功构建重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT,为进一步研究脂质体转染FHIT基因对结肠癌细胞株SW480凋亡作用的影响奠定基础。     

pcDNA3.0-CBP真核表达质粒的构建及对肺腺癌SPC-A1细胞的影响

目的 观察外源性CBP基因稳定转染对人肺腺癌SPC-A1细胞体外生长的影响.方法 构建CBP真核表达质粒pcDNA 3.0-CBP,应用pcDNA 3.0-CBP和空载体质粒pcDNA3.0(-),脂质体转染法转染体外培养的人肺腺癌细胞株SPC-A1,G418(800mg/L)筛选出抗性克隆.Western blot检测转染前后CBP蛋白水平变化,噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长抑制作用,Transwell体外侵袭实验和Wound-healing实验对细胞进行侵袭和迁移能力研究.结果 转染CBP基因的细胞株有目的 基因整合和相应蛋白高表达.MTT检测pcDNA 3.0-CBP转染组活细胞吸光度(0.2787±0.0786)低于未转染组(0.5089±0.1301)和pcDNA 3.0(-)空载体转染组(0.4804±0.1547).pcDNA 3.0-CBP转染组与两对照组吸光度的差异有统计学意义(P<0.01).细胞侵袭实验表明pcDNA 3.0-CBP转染组穿透滤膜数(3.52±0.77)明显少于未转染组(8.17±0.86)和空载体转染组(8.22±1.30),转染组与两对照组侵袭力的差异有统计学意义(P<0.01).细胞迁移实验转染组细胞迁移数(71.30±7.68)明显少于未转染组(119.40±8.38)和空载体转染组(111.41±12.56),转染组与两对照组迁移力的差异有统计学意义(P<0.01).结论 外源性CBP基因稳定转染可抑制人肺腺癌SPC-A1细胞的恶性表型,可能通过对Src家族激酶(SFKs)的负反馈调节抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭.