甲基强的松龙对马兜铃酸致肾小管上皮细胞损害影响

目的 探讨甲基强的松龙(MP)对马兜铃酸(AA)导致的肾小管上皮细胞损伤的影响.方法 AA组以20 mg/L AA刺激近端肾小管上皮细胞株(HK-2),MP组培养体系中加入20 mg/L的MP和AA培养48 h,另设对照组.透射电镜观察细胞的超微结构,采用MTT法观察HK-2细胞活性,应用流式细胞术检测细胞凋亡百分率.结果 与对照组比较,AA组细胞结构发生改变;MP组大部分细胞结构基本正常,部分细胞结构改变明显.与对照组比较,AA组HK-2细胞的活性显著抑制(F=108.522,q=7.215,P＜0.01),AA组和MP组凋亡细胞的比例明显增加(F=143.955,q=39.225、23.453,P＜0.01);MP组凋亡细胞的比例较AA组明显减少,差异有显著性(q=17.052,P＜0.01).结论 MP通过抑制细胞凋亡起到保护HK-2细胞的作用.     

马兜铃酸Ⅰ及马兜铃内酰胺Ⅰ对肾小管上皮细胞损伤的差异

目的:初步探讨马兜铃酸Ⅰ(AA-Ⅰ)及马兜铃内酰胺Ⅰ(AL-Ⅰ)导致肾小管上皮细胞损伤的机制.方法: 以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,分别以不同浓度的AA-Ⅰ(2.5 mg/L)与AL-Ⅰ(5 mg/L)刺激细胞,以流式细胞仪分析细胞DNA含量以了解细胞凋亡情况;采用 ELISA法检测细胞培养上清液中纤连蛋白(FN)及转化生长因子β1(TGF-β1)分泌水平;分别用特异性抗TGF-β1中和抗体阻断TGF-β1作用后,观察AA-Ⅰ与AL-Ⅰ诱导细胞凋亡及FN分泌的改变. 结果: 与对照组相比,AA-Ⅰ刺激12 h后HK-2细胞的TGF-β1分泌水平显著增高,36 h后FN分泌水平明显增加,48 h后HK-2细胞凋亡显著增多,抗TGF-β1中和抗体(5 mg/L)能够抑制AA-Ⅰ诱导的HK-2细胞凋亡(抑制率达63.7%,P<0.001)及FN分泌(抑制率50.2%,P<0.001).与AA-Ⅰ有所不同,AL-Ⅰ刺激HK-2细胞后仅在48 h同时诱导TGF-β1、FN分泌,并导致细胞凋亡,而抗TGF-β1中和抗体(5 mg/L)却不能阻断AL-Ⅰ引起的相应改变.结论: AA-Ⅰ导致肾小管上皮细胞凋亡和FN分泌的作用可能是由TGF-β1所介导的.尽管AL-Ⅰ与AA-Ⅰ同样具有导致细胞凋亡以及细胞外基质成分分泌的作用,但AL-Ⅰ的作用机制有别于AA-Ⅰ,可能通过非TGF-β1机制而发挥作用.     

马兜铃酸对人肾小管上皮细胞损伤的体外实验研究

目的 研究马兜铃酸(aristoloehie acid,AA)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)的损伤及可能机制.方法 将细胞分为4组:正常对照组与AA30、60、120 μmol/L组(n=6),分别作用于HK-2细胞培养48 h后,倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测增殖,流式细胞仪检测凋亡,Western blot分析激活型Caspase-3的表达,全自动生化检测仪测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和B-N-乙酰氨基匍萄糖苷酶(NAG酶)的含量,激光共聚焦扫描荧光显微镜(Laser scanning eonfocal microscope,LSCM)观察α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle aetin,α-SMA)和E-钙黏连蛋白(E-cadherin)的表达,ELISA测定上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和Ⅲ型胶原的分泌.结果 HK-2分别在30、60、120 μmoi/L AA作用48 h后,出现增殖抑制,凋亡增加,激活型Caspase-3表达增多,LDH和NAG酶升高,均旱剂量依赖性.60μmol/1.浓度的AA还表现E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增强,TGF-β1和Ⅲ型胶原分泌明显增加(P<0.05).结论 AA可引起HK-2细胞明显的增殖抑制、凋亡和上皮-间允质转分化呈一定的浓度依赖性.     

黄芪当归合剂抑制马兜铃酸Ⅰ导致的肾小管上皮细胞损伤

目的:探讨黄芪当归合剂(astragalus and angelica mixture, A&A)对外源性马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ, AA-Ⅰ)所造成的肾小管上皮细胞损伤的干预作用.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,在AA-I(2.5 mg/L)刺激细胞4 h后,给予A&A药物血清并使细胞继续生长至48 h,应用流式细胞仪分析细胞DNA含量了解细胞凋亡情况;采用 ELISA法检测细胞培养上清液中纤维连接蛋白(fibronectin, FN)及转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)分泌水平;比较A&A 干预前后AA-I诱导的细胞凋亡、TGF-β1及FN分泌的改变. 结果:正常HK-2细胞能够分泌少量TGF-β1(7.05±1.98 μg/L),正常血清与A&A 均不能够诱导TGF-β1的明显分泌(6.35±1.99 μg/L and 6.57±2.19 μg/L, vs. 对照组, P＞0.05),AA-Ⅰ能够诱导细胞分泌TGF-β1(18.26±5.98 μg/L, vs. 对照组, P＜0.05),与AA-I作用组相比,A&A能够抑制TGF-β1分泌(6.66±0.70 μg/L, vs. AA-I, P＜0.05),抑制率达63.5%;A&A还能够阻断细胞凋亡,阻断率达93.7%(3.32%±0.41% vs. 19.19±6.32%,A&A+AA-I vs. AA-I, P＜0.001),并能抑制AA-I诱导HK-2细胞分泌(1.64±1.11倍vs. 2.93±0.87倍, P＜0.05),抑制率达44%.结论:A&A能够减轻AA-Ⅰ诱导的肾小管上皮细胞损伤,其机制可能与抑制TGF-β1的作用有关.     

马兜铃酸对体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:观察马兜铃酸(aristolochic acid,AA)对体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤作用。方法:体外培养NRK-52E,分别以不同浓度的AA-Na刺激细胞,每组设6个复孔,孵育24 h。透射电镜观察NRK-52E细胞的超微结构,MTT法检测不同浓度AA对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测AA对NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响;检测不同时间段(12、24、48 h)马兜铃酸对NRK-52E细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及内皮素-1(ET-1)mRNA和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。结果:①AA浓度低于10μg/ml时对NRK-52E的增殖无明显影响,20~40μg/ml浓度的AA可明显抑制NRK-52E细胞的增殖;②较高浓度的AA(40μg/ml)可明显刺激细胞凋亡;③AA5、10、20、40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-SMA,其中AA10μg/ml对α-SMA表达较强;④AA刺激NRK-52E细胞24 h后TGF-β1mRNA、ET-1 mRNA表达最多,48 h时表达水平下降,而COL-I的表达水平随时间的延长而上调,呈时间依赖性。结论:AA可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA,即有促转分化作用,且其对NRK-52E细胞的损伤作用呈剂量及时间依赖性。     

马兜铃酸对人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响

目的 研究马兜铃酸(AA)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响.方法 通过Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,western blot法检测凋亡蛋白bcl-2和bax的表达及比色法测定caspase-3的活性.结果 马兜铃酸可引起内皮细胞核出现凋亡形态学改变,且呈浓度依赖方式增加了内皮细胞凋亡率.同时可降低内皮细胞内bcl-2蛋白的表达,增加bax蛋白的表达,使caspase-3活性增加.结论 马兜铃酸可抑制内皮细胞内bcl-2蛋白的表达,促进bax的表达,增加caspase-3的活性,从而使内皮细胞出现凋亡.     

马兜铃酸致肾小管上皮细胞损伤中p53和Caspase-3活性的变化

目的：研究马兜铃酸（AA）对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）毒性作用中053和Caspase-3活性的改变,对其在AA肾毒性作用中的意义进行探讨．方法：用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验测AA对HK-2的直接毒性作用,相差显微镜观察细胞形态学改变,Hoechsd3258染色法观察细胞凋亡形态的改变,流式细胞技术测细胞凋亡百分率,RT-PCR法测p53mRNA的表达水平,分光光度法测细胞Caspase-3活性改变．结果：AA浓度为80,160mg／L时,LDH释放率显著增高（P〈0．01）;10mg／LAA可诱导HK-2细胞凋亡百分率显著增高,AA为40mg／L时,细胞凋亡形态改变最明显和细胞凋亡比例最高（P〈0．01）;各组HK-2细胞053mRNA表达水平有统计学差异;40mg／LAA诱导HK-2细胞凋亡时,细胞内Caspase-3活性显著升高（与正常组比较,P〈0．01）．结论：AA能诱导HK-2细胞凋亡,其凋亡途径可能是非053依赖途径;凋亡过程中存在Caspase-3酶的激活．     

水通道蛋白11参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤机制及水通道蛋白11(AQP11)在损伤过程中的作用。方法:将不同浓度的AA(10、20、40μg/ml)作用于体外培养的HK-2细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT)选择最适浓度AA;用AQP11过表达质粒转染至HK-2细胞并验证,用以观察AQP11是否对AA诱导HK-2细胞转分化具有保护作用。予未转染及转染HK-2细胞分别加入最适浓度AA培养48 h,用ELISA法检测细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量,Real-time PCR检测AQP11 mRNA表达,Western印迹法检测AQP11、结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:MTT法筛选出的AA最适浓度为20μg/ml;转入质粒过表达AQP11培养48 h后AQP11的表达量显著高于空白组(P0.01),提示转染成功。加入20μg/ml AA后,ELISA检测显示,未转染组的TGF-β1表达量较空白组明显上升(P0.05),至48 h达高峰(P0.01),而转染APQ11质粒组则明显低于未转染组(P0.05);PCR检测显示,未转染组AQP11 mRNA的表达量逐渐降低,至72 h显著低于空白组(P0.05),而转染组虽低于空白组(P0.05),但略高于未转染组(P=0.137);Western印迹法检测显示,未转染组α-SMA、CTGF蛋白表达较空白组明显上升(P0.01)、AQP11蛋白逐渐降低(P0.05),转染组48 h的α-SMA、CTGF蛋白表达量均较空白组有所提高(P=0.874,P=0.696),但显著低于未转染组(P0.01)。结论:AA可抑制HK-2细胞增殖,诱导细胞纤维化、坏死;过表达AQP11蛋白可以抑制AA作用下的细胞纤维化发生发展,AQP11表达调控异常可能是AAN的一个重要发病机制。     

不同浓度马兜铃酸对肾小管上皮细胞的毒性作用以及骨形成蛋白-7的抗凋亡作用

目的 探讨不同浓度马兜铃酸（AA）对肾小管上皮细胞（RTECs）毒性作用的差异,以及BMP-7对AA所诱导RTECs凋亡的保护作用。 方法 （1）用浓度分别为5、10、20、40、80、160µg/ml AA刺激体外培养人近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,应用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测不同浓度AA对HK-2细胞的直接毒性作用,相差显微镜观察细胞形态学改变,用Hoechst33258染色法观察不同浓度AA诱导的HK-2细胞凋亡核形态的改变,计算细胞凋亡百分率;（2）用300ng/ml BMP-7处理经AA（20µg/ml和40µg/ml）诱导的HK-2细胞48h,然后Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡百分率,分光光度法检测Caspase-3蛋白酶活性。 结果 当AA浓度达到80μg/ml时,细胞LDH释放率明显升高（P<0.001）;而AA浓度为10μg/ml时,细胞凋亡率开始明显升高（P<0.001）,AA浓度为40μg/ml时,细胞凋亡率最高;BMP-7处理后,细胞凋亡率和Caspase-3蛋白酶活性明显下降（P<0.01）。 结论 大剂量AA致RTECs坏死,中小剂量AA致RTECs凋亡;BMP-7可减轻AA诱导的RTECs凋亡,其作用可能部分通过抑制Caspase-3酶活性而实现。     

醋酸铅对体外培养人肾小管上皮细胞的毒性效应

目的  探讨醋酸铅对人肾小管上皮细胞系HK-2的毒性效应。方法  醋酸铅处理HK-2后,Giemsa及HE染色法检测观察细胞形态学变化;细胞免疫化学法检测凋亡相关蛋白P53、Bax、Bcl-2的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果  经10μmol/L和20μmol/L醋酸铅处理48h后,Giemsa及HE染色均显示醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。HK-2的细胞免疫化学结果示醋酸铅组的P53和Bax阳性表达升高,而Bcl-2的阳性表达下降。流式细胞仪检测结果表明,醋酸铅组细胞凋亡率较对照组明显升高。结论  醋酸铅可损伤HK-2,促进其凋亡及影响肾脏。     

马兜铃酸Ⅰ诱导人肾小管上皮细胞转分化机制的初步探讨

目的:探讨马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2)转分化的可能机制.方法:将HK-2细胞分为对照组和AAI组,两组细胞分别培养24h、48h、72h.应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle acfin,α-SMA)的表达;ELISA法定量检测上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达;逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)检测结缔组织生长因子(connection tissue growth factor,CTGF)mRNA的水平变化.结果:20μg/ml的AAI可诱导HK-2细胞肥大、拉长呈梭形,TGF-β1分泌增加,CTGFmRNA合成增加,α-SMA表达增强.这些作用呈一定的时间依赖性.结论:AAⅠ可诱导肾小管上皮细胞转分化,可能与TGF-β1分泌增多有关,而TGF-β1可能通过下游CTGF发挥生物学效应.     

人参二醇组皂甙对人肾小管细胞增殖的影响

目的：研究不同浓度的人参二醇组皂甙对培养的人肾小管细胞增殖的影响。方法：用含有7种不同浓度的人参二醇组皂甙（0ug.ml^-1、5ug.ml^-1、10ug.ml^-1、25ug.ml^-1、50ug.ml^-1、75ug.ml^-1、100ug.ml^-1）的培养基,在96孔培养板中培养人肾小管细胞96小时后,以MTT法判定细胞的增殖情况。结果：与对照组比较,在5-25ug.ml^-1浓度范围内,人参二醇组皂甙可明显地促进肾小管细胞增殖;在50ug.ml^-1时,其作用不明显;在75-100ug.ml^-1。则抑制其生长。结论：适量的人参二醇组皂甙能促进肾小管细胞的增殖,浓过高则对其生长产生抑制作用。     

高糖诱导人肾小管上皮细胞凋亡的机制研究

目的探讨高血糖对人肾小管上皮细胞活性氧（ROS）产生及凋亡的影响。方法将人近端肾小管上皮细胞（HKC）分别以不同时间在含有5.5 mM D（右旋）-葡萄糖（正常糖对照组）、25 mMD-葡萄糖（高糖组）和20 mML（左旋）-葡萄糖＋5.5 mMD-葡萄糖（渗透压对照组）的DMEM培养基中培养。用化学发光法特异性检测细胞内H2O2水平。将细胞用荧光染料CM-H2DCFDA标记后用激光共聚焦显微镜检测活细胞中总ROS水平。用荧光染料Hoechst33258对细胞染色后在荧光显微镜下计数细胞凋亡率。用AnnexinV-FITC/碘化丙锭双染后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。在高糖组中同时加入30 mM的抗氧化剂牛磺酸,观察其对细胞凋亡的影响。结果化学发光法检测和共聚焦显微镜检测显示高糖可明显促进肾小管上皮细胞内活性氧的产生,与其他两对照组比较有显著差异（P〈0.01）;Hoechst33258染色法检测和流式细胞仪检测分析显示高糖可明显诱导肾小管上皮细胞的凋亡发生,与其他两对照组比较有显著差异（P〈0.01）;流式细胞仪检测分析显示抗氧化剂牛磺酸可明显抑制高糖诱导的肾小管细胞凋亡,与高糖组比较有显著差异（P〈0.01）。结论高糖可通过促进细胞内生成过量ROS而诱导肾小管细胞凋亡发生,抗氧化剂可阻断高糖诱导的肾小管细胞凋亡。     

冬虫夏草醇提物对T淋巴细胞亚群的影响

经流式细胞计分析,冬虫夏草醇提制剂(CS—Ⅱ)能使小鼠外周血及脾脏 T 淋巴细胞亚群中 Lyt-1~+细胞(T 辅助细胞)数及 Lyt—1/Lyt—2比例(T 辅助细胞/T 抑制细胞)比对照组显著提高。此外,试验组脾重及吞噬细胞数、吞噬率亦显著提高。     

冬虫夏草对小鼠造血干细胞的影响

本文采用造血干细胞(CFU-S)脾结节形成方法观察冬虫夏草醇提结晶制剂(CS-Cr)对LACA小鼠骨髓CFU-S的影响。结果表明,CS-Cr腹腔注射给药后可使小鼠CFU-S产率和自杀率均明显增高,提示 CS-Cr经体内作用可以促进小鼠CFU-S增殖,更多的CFU-S由G_0期进入S期。     

冬虫夏草对小鼠骨髓粒—单系祖细胞增殖的影响

4—8g/kg的冬虫夏草能明显促进小鼠骨髓粒-单系祖细胞(CFU—GM)增殖,其作用维持约4天;剂量大于10g/kg时,可抑制CFU—GM增殖。4mg/kg的三尖杉酯碱(Ha)明显抑制小鼠CFU—GM增殖;但若先用冬虫夏草(6g/kg)处理小鼠,上述剂量的Ha则可使CFU—GM产率维持于对照组水平。     

冬虫夏草对小鼠红系造血机能的影响

用微量甲基纤维素培养方法探讨冬虫夏草结晶制剂(CS-Cr)对小鼠骨髓红系祖细胞(CFU-E和BFU-E)增殖的影响。实验结果表明,CS-Cr明显提高骨髓CFU-E和BFU-E产率、自杀率,并能对抗三尖杉酯碱对造血机能的损害。采用液体培养技术发现CS-Cr促进骨髓成纤维祖细胞(CFU-F)增殖,其产率变化与CFU-E和BFU-E产率变化一致。     

IL-1受体拮抗剂对培养人肾小管细胞的影响及机制研究

目的:研究IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)抗肾缺血再灌流性兔血清致培养人肾小管细胞损伤的作用及机制。方法:健康家兔16只,随机分为对照和缺血再灌流(IR)组,IR组作双肾动脉夹闭1小时再灌流2小时;对照组仅模拟实验过程,不夹闭肾动脉。分别提取其血清。肾小管细胞培养分对照组(DMEM+小牛血清);SC组(DMEM+对照兔血清);SIR组(DMEM+IR肾损伤性兔血清);IL-1ra+SIR组(DMEM+IR肾损伤性兔血清+IL-1ra)。培养96小时时,测定其增殖状况和细胞存活率,细胞或培养液中MDA、SOD、NO、LDH、Na~+-K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATP酶。结果:SIR组MDA、NO含量、LDH活力比对照组、SC组高(P<0.05),对照组、SC组和IL-1ra+SIR组间比较差异无显著性;肾小管细胞中的SOD活力,对照组最高,IL-1ra+SIR组次之,SC组又次之,SIR组最低,除IL-1ra+SIR组与SC组外,其余组间差异均有显著性(P<0.05);Na~+K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATP酶的活力在SIR组均较对照组和SC组低,差异有显著性。对照组、SC组和IL-1ra+SIR组间差异无显著性。结论:IL-1ra具有减轻IR性肾损伤兔血清致培养人肾小管细胞损伤的作用。     

EFFECTS OF CORDYCEPS SINENSIS PREPARATION ON BODY PROTEIN AND AMINO ACID METABOLISM IN PATIENTS AND RATS WITH CHRONIC RENAL FAILURE

Objective To study the effects of Cordyceps sinensis (CS) on the metabolism of body pro-tein and intra-extracellular amino acids in patients with chronic renal failure( CRF ) , and on the rates of proteinsyn thesis in rats with CRF. Methods In patients with CRF, free amino acid concentrations in plasma and skeletal muscle before and after CS treatment were measured by the LKB-4400 amino acid automatic analytical instrument and the changes of body protein metabolism were observed by the method of ^15N-labeled glycine.Meanwhile, the rates of protein synthesis in liver (SL% /d) and muscle (SM% /d) of rats with CRF were de-terminedd by ^3H-phenylalanine radioactive tracer. Results After patients with CRF were treated by CS, the Leu, Ile, Thr , Lys, Cys, Tyr concentrations in plasma approached the normal levels. In one sample of skele-tal muscle the Thr and Lys concentrations approached the normal, whereas both the intracellular and extracellu-lar Val concentrations were still remarkably decreased as compared with the normal controls. Moreover, the ni-trogen flow rate (Q), rates of protein synthesis (S) and catabolism (C), and amino nitrogen utilization ratio(S/Q) in patients with CRF and the SL% /d and SM% /d in rats with CRF were significantly increased as com-pared with those before CS treatment. Conclusion CS can notably improve the amino acid metabolism, pro-mote the body protein synthesis in patients with CRF, and increase the rates of SL% /d and SM% /d in rats with CRF.