慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。     

慢病毒载体用于人类疾病基因治疗研究的进展

慢病毒载体系统是一种较为新型的基因治疗载体系统，它不仅可以高效转导处于分裂期的靶细胞，而且可以转导非分裂期的细胞，目前的研究表明它是一个有应用前景的基因治疗转移系统，本文从慢病毒载体的结构，感染慢，慢病毒载体系统的应用及安全性方面进行了综述。     

慢病毒载体用于人类疾病基因治疗研究的进展

慢病毒载体系统是一种较为新型的基因治疗载体系统,它不仅可以高效转导处于分裂期的靶细胞,而且可以转导非分裂期的细胞。目前的研究表明它是一个有应用前景的基因治疗转移系统。本文从慢病毒载体的结构、感染性、慢病毒载体系统的应用及安全性方面进行了综述。     

慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术,在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用,有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。     

YWHAZ重组腺病毒及逆转录病毒的制备

目的制备YWHAZ重组腺病毒及逆转录病毒,在293T细胞中验证基因表达情况。方法将YWHAZ基因分别克隆至腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV-IRES-GFP及逆转录病毒质粒pLXSN-IRES-GFP,并用酶切鉴定、PCR及测序验证后分别转染至HEK 293T及Ampho293细胞,构建重组腺病毒及逆转录病毒。重组病毒分别感染293T细胞,观察荧光验证病毒侵染效果,RT-PCR检测YWHAZ基因表达情况。结果 PCR、酶切鉴定及测序分析,重组腺病毒及逆转录病毒构建正确,感染293T细胞后可使其高效过表达YWHAZ mRNA。结论成功构建了YWHAZ基因重组腺病毒载体及逆转录病毒载体,为体内外进一步研究YWHAZ基因及其相关信号通路在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

GFP在人脐血CD34~+细胞中的表达及意义

目的探讨慢病毒载体在CD34+脐血细胞(CBCs)中的基因转导效率,为基因治疗的临床应用提供关键材料。方法应用1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而成的第三代自身失活(self-inactivating,SIN)慢病毒载体(lentiviralvector)系统,通过流式细胞术检测基因导入细胞百分比,评价该载体系统在人CBCs中的基因转导效率。结果 HIV载体的转导效率在95%以上。结论基于慢病毒载体基因转导的高效性,该载体系统可作为CD34+CBCs基因转导的极好工具。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题.应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题.目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装.方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒.用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序.抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因.pMD1 8-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒.     

腺病毒相关病毒介导基因治疗的研究进展

基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体两类.常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒及腺病毒相关病毒(AAV)等.腺病毒相关病毒是一个新的有前景的病毒载体,与逆转录病毒和腺病毒相比,具有以下优点:(1)宿主范围广,能感染哺乳类动物(人、鼠、猴、免)的多种类型的细胞.     

基因治疗中慢病毒载体的最新进展

基因治疗有望成为治疗遗传病、感染性疾病及肿瘤的有效手段.高效的基因转移方法为基因治疗的关键,目前应用最广的是来源于致瘤型逆转录病毒为代表的简单的逆转录病毒载体,但该类载体不能有效地转染非分裂细胞如造血干细胞及终末分化的神经细胞等.以人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)为代表的慢病毒为复杂的逆转录病毒.慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗中载体研究的热点.近年来对其基本生物学特性、载体改造及其应用研究均取得了较大进展.     

基因洽疗中慢病毒载体的最新进展

基因治疗有望成为治疗遗传病、感染性疾病及肿瘤的有效手段。高效的基因转移方法为基因治疗的关键,目前应用最广的是来源于致瘤型逆转录病毒为代表的简单的逆转录病毒载体,但该类载体不能有效地转染非分裂细胞如造血干细胞及终末分化的神经细胞等。以人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)为代表的慢病毒为复杂的逆转录病毒。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗中载体研究的热点。近年来对其基本生物学特性、载体改造及其应用研究均取得了较大进展。     

构建携带p73α基因的慢病毒表达载体及检测其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建携带p73α基因的慢病毒系统表达载体,成功感染人卵巢癌细胞PEO1后检测其蛋白质的表达。方法:将采用PCR技术获得全长p73α基因亚克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒表达质粒PCDH-p73α,验证成功后与包装质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、Pvsv-G共转293T细胞,获得重组慢病毒Lenti p73α后感染靶细胞人卵巢癌细胞PEO1(p73α基因表达缺失)后,RT-PCR和Western Blotting验证PEO1细胞中Lenti p73α的表达。结果:经酶切鉴定及基因测序证实PCDH-p73α中携带正确的p73α基因序列,与GenBank中序列一致;转染包装细胞293T后产生慢病毒颗粒能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60%,并且存在p73α基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论:本实验成功构建了PCDH-p73α慢病毒表达载体,包装成功后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

腺病毒受体在不同白血病细胞中的表达及意义

高效转移目的基因进入细胞,尤其是处于非分裂静止期的细胞,是基因治疗至关重要的步骤.由于腺病毒载体(Ad-Vec)具有制备简便、宿主范围广、感染性强、包装容量大、病毒繁殖滴度高和安全性好的特点,因此,AdVec已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统.然而,我们以往的研究发现,传统的以5型腺病毒为基础构建的AdVec即AdSVec很难高效感染多种不同的白血病细胞如K562细胞,但是,它们均能被新型嵌合的AdVec即Ad5F35AdVec有效感染[1].为进一步探讨其机制,我们分析了腺病毒受体(CAR)在不同白血病细胞中的表达.     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

基因治疗中慢病毒载体的最新进展

基因治疗有望成为治疗遗传病、感染性疾病及肿瘤的有效手段。高效的基因转移方法为基因治疗的关键，目前应用最广的是来源于致瘤型逆转录病毒为代表的简单的逆转录病毒载体，但该类载体不能有效地转染非分裂细胞如造血干细胞及终末分化的神经细胞等。以人类免疫缺陷病毒I型（HIV－I）为代表的慢病毒为复杂的逆转录病毒。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗中载体研究的热点。近年来对其基本生物学特性、载体改造及其应用研究均取得了较大进展。     

高效绿色荧光蛋白基因标记系统的建立及其初步应用

逆转录病毒载体编码的众多报告分子被广泛用于分析基因转导率、分选或示踪基因修饰靶细胞 ,特别在改进基因转导条件、阐明造血干细胞 (ＨＳＣ)生物学特性和判定白血病复发的细胞来源等方面发挥了重要作用[1,2 ] 。作为新一代的报告分子 ,增强型绿色荧光蛋白 (ＥＧＦＰ)最近已被用于造血细胞的基因转移和示踪肿瘤转移与血管形成等研究[3 ] 。我们曾建立双启动子逆转录病毒载体介导的ＥＧＦＰ基因转移系统 ,但发现转导靶细胞后荧光强度较低[4 ] 。为提高靶细胞ＥＧＦＰ的表达 ,我们构建了仅携带ＥＧＦＰ单基因的逆转录病毒载体Ｇ1ＦＰ ,并在不…     

ELL慢病毒表达载体的构建及其感染前列腺癌PC3细胞的研究

目的构建ELL基因的慢病毒表达质粒,探讨其感染人前列腺癌PC3细胞的可行性。方法将含有全长ELL的质粒和慢病毒表达载体经双酶切后连接,构建成重组慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP—ELL。对慢病毒载体质粒进行双酶切和测序鉴定后,制备包装病毒并转染人前列腺癌细胞系PC3。结果慢病毒载体质粒pCDH1-MCS--EF1-copGFP—ELL的酶切和测序结果与预计的序列一致。慢病毒感染人前列腺癌PC3细胞后能稳定高表达ELL。结论成功构建了ELL的慢病毒表达载体,ELL可被成功转染人人前列腺癌细胞。     

新型逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因转移小鼠造血干／祖细胞

为探讨逆转录病毒介导的外源基因转导对骨髓造血重建的影响,我们以人多药耐药基因(mdr-1)为报告基因,采用包含Friend脾灶形成病毒(spleen focus-forming vims)和鼠胚胎干细胞病毒序列的新型逆转录病毒载体SF-MDR,以病毒包装细胞与小鼠造血细胞体外共培养法进行基因转染,并对基因转导后造血细胞的体外耐药能力及体内造血重建能力进行了观测。结果表明,该载体可有效地介导mdr-1基因转导,明显提高小鼠骨髓造血细胞对秋水仙素及紫杉醇的耐受能力,对细胞体内造血重建能力没有影响,体内移植8个月后经紫杉醇体内筛选,7/7的小鼠可于外周血细胞基因组DNA中检出外源mdr-1基因的存在。     

逆转录病毒载体介导PIG—A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG-A cDNA转导至突变型K562细胞中,观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,BamH I及Xho I双胁切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞,收集病毒上清感染突变型K562细胞,流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。G418筛选后,病毒滴度测定达(1．6±0．2)×10~4CFU/mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±0．7％及21．3％±0．3％(P＜0．01)。结论成功构建了PIG-A基因逆转录病毒载体,感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。     

组织工程研究中病毒表达载体的构建

组织工程中的表达载体按构建来源类型可分为质粒和病毒表达载体。其中病毒表达载体包括腺病毒、反转录病毒和慢病毒表达载体。腺病毒是一种线状DNA肿瘤病毒,基因组内有14个基因。反转录病毒是使最常用的一种病毒载体,是由具有感染性的小白鼠白血病病毒改造而来。慢病毒表达载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。