幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的表达及免疫原性研究

目的构建表达幽门螺杆菌融合蛋白粘附素-细胞空泡毒素A-霍乱毒素B亚单位(HpaA-CtxB-VacA,HCTV)的原核表达载体,并诱导表达,为制备具有治疗与预防作用的多联疫苗奠定基础。方法用PCR技术从pQE-hctB扩增hpaA和ctxB目的基因片段,从pQE30-V质粒扩增出vacA基因,同时插入表达载体pQE-30,构建成pQE-hctv。再将pQE-hctv转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果。Western blotting鉴定其抗原性。结果融合蛋白的相对分子量约为68000,可溶性表达占全菌的15%以上,经亲和层析后可获得纯度为90%以上的重组蛋白。Western blotting分析其能分别与HpaA抗血清、VacA抗血清和CT抗血清特异性反应。结论重组表达质粒pQE30-hctv表达成功,而且具有各自蛋白的抗原性,为进一步研究融和蛋白的功能和制备集预防和治疗为一体的Hp候选口服疫苗提供基础。     

人幽门螺杆菌VacA与HspA双价候选疫苗抗原的克隆表达及鉴定

目的　构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和细胞空泡毒素 (VacA)编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E coliBL2 1中表达 ,研究其抗原性 ,为疫苗的开发奠定基础。方法　利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增HspA、VacA编码基因片段 ,将目的基因HspA、VacA与载体 pET32a(+)分别进行双酶切后 ,连接、测序 ;同时将重组载体 pET32a(+) /HspA和 pET32a(+) /VacA分别经Xhol、BamHⅠ双酶切 ,通过凝胶电泳回收 pET32a(+) /HspA和VacADNA片段 ,经T4连接酶将HspA和VacA编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中表达 ,表达产物经纯化后 ,以Westernblot法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpHspA和VacA编码基因 ,由 10 80bp组成 ,与GenBank报道的相比较 ,本实验克隆的基因有 3 4 0 %的碱基发生变异 ,导致 1 10 %的氨基酸残基改变 ;经SDS -PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 5 9× 10 3 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为 2 0× 10 3 ,可溶性表达产物占全菌总蛋白的 18 96 % ;重组蛋白经Ni2 + -NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达95 %以上 ;用Westernblot法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础。方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA和ureB基因,分别克隆入pNEB193中。测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Westernblot分析结果显示,在119kDa处出现特异杂交带。结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性。     

幽门螺杆菌金属蛋白酶原核表达载体的构建与重组表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)金属蛋白酶(metalloprotease, Mtp)基因mtp与麦芽糖结合蛋白基因mbp融合表达载体,诱导Mtp重组表达并纯化表达产物,为Hp致病机制和疫苗研究奠定基础。方法应用PCR从Hp郑州分离株MEL-Hp27的DNA扩增mtp基因,经纯化回收后与克隆载体pMD19-T连接,并进行测序验证。对重组质粒pMD19-T-mtp双酶切,酶切目的片段克隆至表达载体pMAL-c2X,然后用重组质粒pMAL-mtp转化大肠埃希菌(E.coli TB1)。从大肠埃希菌重组子中提取重组质粒,进行酶切和测序鉴定。用分光光度计测定重组菌的生长曲线。用IPTG诱导mtp表达,用SDS-PAGE法分析表达产物,并用Amylose树脂预装柱纯化Mtp蛋白。结果 PCR扩增的mtp基因片段长度为621 bp,重组菌株的酶切和测序鉴定正确;重组菌生长曲线显示重组质粒的转入对受体菌的生长无显著影响;Mtp诱导表达和纯化产物的SDS-PAGE显示,Mtp表达产物为相对分子质量为66.4×10~3的水溶性融合蛋白(rMtp),纯化产物的纯度约为85.6%。结论成功构建mtp基因与麦芽糖结合蛋白mbp基合表达载体,并纯化制备了重组蛋白,为探索Mtp在Hp感染发病机制和抗Hp感染疫苗研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌金属蛋白酶原核表达载体的构建与重组表达及纯化北大核心CSCD

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)金属蛋白酶(metalloprotease, Mtp)基因mtp与麦芽糖结合蛋白基因mbp融合表达载体,诱导Mtp重组表达并纯化表达产物,为Hp致病机制和疫苗研究奠定基础。方法应用PCR从Hp郑州分离株MEL-Hp27的DNA扩增mtp基因,经纯化回收后与克隆载体pMD19-T连接,并进行测序验证。对重组质粒pMD19-T-mtp双酶切,酶切目的片段克隆至表达载体pMAL-c2X,然后用重组质粒pMAL-mtp转化大肠埃希菌(E.coli TB1)。从大肠埃希菌重组子中提取重组质粒,进行酶切和测序鉴定。用分光光度计测定重组菌的生长曲线。用IPTG诱导mtp表达,用SDS-PAGE法分析表达产物,并用Amylose树脂预装柱纯化Mtp蛋白。结果 PCR扩增的mtp基因片段长度为621 bp,重组菌株的酶切和测序鉴定正确;重组菌生长曲线显示重组质粒的转入对受体菌的生长无显著影响;Mtp诱导表达和纯化产物的SDS-PAGE显示,Mtp表达产物为相对分子质量为66.4×10^3的水溶性融合蛋白(rMtp),纯化产物的纯度约为85.6%。结论成功构建mtp基因与麦芽糖结合蛋白mbp基合表达载体,并纯化制备了重组蛋白,为探索Mtp在Hp感染发病机制和抗Hp感染疫苗研究奠定了基础。     

食物中毒菌多联融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的表达及免疫学特性研究

目的构建食物中毒菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备抗5种毒素的血清抗体。方法采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌的5个毒素基因片段进行串联,并定向克隆到表达载体pET-22b(+)的NcoI和XhoI位点之间,构建五联融合毒素基因及重组表达载体,表达产物经切胶回收初步纯化后免疫獭兔,制备抗血清,利用ELISA和琼脂扩散试验检测抗体和5种毒素反应的特异性和敏感性。结果构建了重组融合毒素(命名为F5)Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因和重组表达载体F5-22b,且在表达宿主菌E.coliBL21中得到有效表达(9.90%),基因序列全长2937bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,融合蛋白分子量112.369ku,测序结果与设计序列(GenBank)100%同源。表达产物经初步纯化后免疫獭兔获得抗五种毒素的血清抗体,且具有较高的特异性和敏感性。结论成功构建了融合毒素基因,获得了抗五种毒素的血清抗体,本实验结果为下一步建立食品广谱、快速免疫学检测新方法奠定了基础。     

丙型肝炎NS5ATP6基因原核表达载体的构建和表达纯化及多克隆抗体的制备

目的构建丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式激活蛋白6基因的原核表达载体并进行表达、鉴定。方法从已构建的pGBKT7-NS5ATP6质粒上切取NS5ATP6基因,再克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP6表达重组体。结果以pET32a( )-NS5ATP6重组体分别转化DH5α和Rosseta大肠埃希菌后,经IPTG诱导,pET32a( )-NS5ATP6表达出分子量为41KD左右的重组蛋白。免疫动物并经Westernblot检测证实其具有良好的抗原性。结论成功地构建了原核表达载体pET32a( )-NS5ATP6,诱导表达和纯化了NS5ATP6融合蛋白,并制备了该蛋白的多克隆抗体,为下一步该基因功能研究奠定了基础。     

SARS-CoV GDH株N蛋白全长基因克隆及其可溶性表达

目的构建SARS冠状病毒N蛋白的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达并纯化,鉴定其抗原性。方法以我国SARS冠状病毒GDH株总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增N蛋白的全长基因,TA克隆后测序。构建pET-23d的N基因表达载体,用IPTG诱导目的蛋白表达,利用硫酸铵沉淀、分子筛层析及离子交换层析纯化重组蛋白,免疫印迹鉴定重组蛋白。结果RT-PCR扩增出1269bpSARS冠状病毒N蛋白的基因片段,其序列分析结果与SARS-CoVGD01、BJ01株的同源性为99.92%;该基因在大肠杆菌表达系统中高效表达,占可溶性蛋白的33.57%,表达产物为非融合的可溶性蛋白,Westernblot结果显示重组N蛋白具有良好的抗原性;纯化后重组N蛋白纯度为92.9%。结论成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒,并在大肠杆菌中以非融合蛋白的形式得到高效的可溶性表达,为SRAS的诊断和疫苗的研制奠定了基础。     

空肠弯曲菌CadF蛋白的原核表达与产物分析

目的构建空肠弯曲菌cadF基因重组表达质粒pET30a(+)-cadF,分析其在大肠埃希菌中的表达情况及其融合蛋白的抗原性。方法用PCR方法扩增cadF基因,构建重组克隆质粒和表达质粒,经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后在E.coli(DE3)原核表达系统中诱导表达,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定表达蛋白,Western blot分析其抗原性。结果含重组表达载体pET-30a(+)-cadF中的cadF基因序列经测序证实与出发菌株cadF基因序列100%同源,并成功诱导表达CadF蛋白,Westernblot显示该CadF融合蛋白能被抗空肠弯曲菌多克隆兔血清识别。结论成功构建了空肠弯曲菌cadF基因重组表达载体,表达产物具有抗原性。     

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法，为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA，用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插人到表达载体pMAL-c2X中，用重组质粒转化大肠杆菌(E．coil TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料，制备层析柱，将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa，融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％；纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E．coli TB1中能够高效表达；用多糖树脂作为填充料，进行亲和层析的方法，具有良好的纯化效果。     

High prevalence of potentially virulent strains of Helicobacter pylori in the general male British population

BACKGROUND: Strains of Helicobacter pylori that express the cytotoxin associated gene product A (CagA) may be more strongly associated with serious gastric diseases, such as gastric cancer and peptic ulceration, than other strains. Data, however, are sparse on the prevalence, risk factors, and other correlates of these strains in the general population. AIM: To characterise aspects of the seroepidemiology of CagA(+) strains of H pylori in the general British population. METHODS: We measured serum IgG antibodies to mixed H pylori antigens and separately to CagA in 1025 men aged 40-59 years who were randomly selected from a larger group of participants in a community based survey conducted in 18 different British towns. RESULTS: Overall, 44% (95% confidence interval 41-47%) of the men were seropositive to CagA antibodies, representing about 61% (57-65%) of the men seropositive to mixed antigen H pylori. The risk factors for seropositivity to CagA antibodies were similar to those for seropositivity to mixed antigen H pylori, apart from an increased prevalence of reported bedroom sharing in childhood (p<0.01). CONCLUSION: In a nationwide study of potentially virulent H pylori strains, there was a high prevalence of the infection, with some evidence that acquisition of such strains might occur earlier in life than other strains.     

CagA+幽门螺杆菌裸鼠感染模型的建立

目的用携带ｃａｇＡ基因的Ｈｐ成功感染ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠。方法分别采用ｃａｇＡ基因阳性和阴性的具有较强动力的新鲜Ｈｐ分离菌株,通过灌胃方式感染ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠,感染后４周和８周分两批处死,进行微生物学和病理组织学检查。结果灌喂８周后,ｃａｇＡ＋实验组和ｃａｇＡ－实验组均成功定植Ｈｐ（１６／１６）;ｃａｇＡ＋组胃粘膜表现明显炎症及坏死病变,而ｃａｇＡ－组仅有轻微炎症发生。结论建立典型的Ｈｐ动物感染模型应选择ｃａｇＡ＋菌株。     

湖北地区幽门螺杆菌VacA基因分型及疾病相关性分析

目的了解湖北地区幽门螺杆菌（Hp）空泡毒素基因（vacA）不同噩型及其与慢性胃炎（CG）和慢性消化性溃疡（CPU）之间的相关性。方法采用共享引物PCR技术和特异的PCR分型引物，对74例CG或CPU患者胃黏膜活检组织Hp分离株进行分型，并分析不同亚型与这两种疾病的相关性。结果湖北地区的HpvacA基因主要以S1a—m2型为主，vacA的优势亚型分布与上海和广州相似．除了s2型以外，sla—ml、S1b—m1、s1b—m2、s1c—m1和S1c—m2均有分布；另有8株不能被完全分型。结论湖北地区Hp vacA基因的不同亚型与CG和CPU之间不存在相关性，CG和CPU的引发因素有待进一步研究。     

中国幽门螺杆菌胃上皮细胞白细胞介素-8的转录能力

目的探讨中国幽门螺杆菌(Hp)的空泡毒素基因(vacA)型及cag致病岛对胃上皮细胞白细胞介素-8(IL-8)转录的影响.方法以基因测序与Southern杂交法确定HpvacA基因型及cag致病岛状态;构建带有IL-8报告基因的人胃癌细胞系L5F11,用液体闪烁计数仪测定荧光素酶活性(IL-8转录),用HeLa细胞测定空泡毒素活性.结果所有cag致病岛完整菌株(15株)较野生型cag致病岛阴性菌株G50诱导荧光素酶活性[记数/分(cpm)]明显增强[(0.47±0.19)×106cpm比(0.13±0.02)×106cpm,P＜0.01];而cag致病岛部分丢失菌株(4株)荧光素酶活性与G50差异无显著性[(0.23±0.08)×106cpm比(0.13±0.02)×106cpm,P＞0.05];vacA基因s1/m1型菌株(5株)较s1/m2型菌株(14株)空泡毒素活性增强(P＜0.01),但二者诱导荧光素酶活性差异无显著性[(0.29±0.12)×106cpm比(0.53±0.41)×106cpm,P＞0.05].结论中国Hp诱导胃上皮细胞IL-8转录能力与cag致病岛状态密切相关,而与vacA基因型无明显关系.     

太原地区不同临床型胃疾患与幽门螺杆菌感染及其毒力相关基因cagA关系的探讨

目的探讨幽门螺杆菌（Hp）感染、cagA^＋-Hp与胃部疾病严重程度的关系。方法胃镜直视下取102例胃粘膜组织并采血,分离血清。应用Hp-ureA-PCR,ELISA,细菌培养3种方法确定Hp感染例数,用PCR检测cagA-Hp基因。结果102例胃疾患病人,确定Hp感染76例,其中57例检测到cagA-Hp基因,检出率为75.00%。各型胃疾患病人cagA检出率分别为：CSG 52.38%（11/21）,CAG 92.31%（12/13）,GU81.82%（18/22）,GC 80.00%（16/20）。结论1）各种胃部疾病均与Hp感染有关,但单纯的Hp感染不足以解释临床结局的多样性;2）cagA^＋-Hp与胃部疾患的严重程度相关,携带有cagA的Hp可能具有较强的致病性,但其具体的致病机理尚需进一步阐明。     

中国幽门螺杆菌vacA基因的等位变异

目的 明确中国幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ）全长ｖａｃＡ基因的等位变异及其与西方主要菌株基因序列的差异。方法 从５例胃病患者胃黏膜粘栓组织中分离培养２２个单个Ｈｐ克隆,以Ｗｅｓｔｅｒｍ ｂｌｏｔ确定ｖａｃＡ表型特点,以体外细胞毒性试验研究其活性。然后选择５株有代表性的克隆进行基因组ＤＮＡ抽提、ＰＣＲ扩增及ｖａｃＡ基因全序列测定、分析。结果 ５株中４株ｖａｃＡ表达阳性。只     

胃癌组织中幽门螺杆菌cagA和vacA的表达及与其感染的相关性

目的:研究HpyloricagA和HpylorivacA在胃癌、胃黏膜不典型增生和胃炎组织中的表达及与Hpylori感染的相关性.方法:采用Warthin-Starry嗜银染色法检测胃癌组织39例,胃黏膜不典型增生组织24例和慢性胃炎组织33例中Hpylori感染情况;PCR法检测上述标本中HpyloricagA和HpylorivacA的表达.结果:胃癌组织中Hpylori,HpyloricagA 株和HpylorivacA 株感染率显著高于慢性胃炎组织(χ2=7.00,P<0.05;χ2=15.20,P<0.05;χ2=12.43,P<0.05);胃黏膜不典型增生组织中Hpylori,HpyloricagA 株和HpylorivacA 株感染率显著高于慢性胃炎组织(χ2=6.25,P<0.05;χ2=11.04,P<0.05;χ2=11.61,P<0.05);低分化胃癌组织中Hpylori,HpyloricagA 和HpylorivacA 株感染率显著高于高中分化胃癌组织(χ2=8.19,P<0.05;χ2=13.14,P<0.05;χ2=6.62,P<0.05).慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中Hpylori与HpyloricagA和HpylorivacA表达均呈正相关(慢性胃炎:r=0.56,P<0.01;r=0.64,P<0.01;不典型增生组织:r=0.64,P<0.01;r=0.92,P<0.01;胃癌:r=0.90,P<0.01;r=0.95,P<0.01).结论:Hpylori感染是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌发展的重要启动因子,Hpylori感染可能通过诱导cagA表达促使胃黏膜上皮细胞增殖加快,诱导vacA表达促使胃黏膜上皮细胞损伤;他们的协同作用可能在胃癌发生、发展过程中发挥了重要作用.     

幽门螺杆菌vacA基因型及其表达产物与胃十二指肠疾病关系的研究

目的 探讨幽门螺杆菌ｖａｃＡ基因型及其表达产物－ＶａｃＡ与胃十二指肠疾病之间的关系。方法 用聚合酶链反应技术测定６２株从慢性胃炎,消化性溃疡和胃癌患者中分离获得的幽门螺杆菌（Ｈｐ）菌株的ｖａｃＡ基因型,用Ｈｅｌａ细胞测定Ｈｐ菌株体外ＶａｃＡ活性。     

Mouse model of gastric infection with cytotoxin-expressing strain of Helicobacter pylori in studying of pathogenesis of chronic gastric ulcer

Abstract Helicobacter pylori is a major risk factor for peptic ulcer, but studies on the role of H. pylori infection in gastric pathology are limited due to lack of convenient models resembling H. pylori infection in humans. We studied the effects of inoculation of conventional BALB/c mice with a toxigenic (cytotoxin associated gene A (cagA)+ and vacuolating cytotoxin gene A (vacA+) H. pylori strain on the course of healing of gastric ulcers. Following inoculation of toxigenic H. pylori or vehicle, gastric ulcers were produced in mice, which were then killed either at day 0 or after 2, 4, 7, 14 or 28 days and ulcer area and gastric blood flow (GBF) were determined. Gastric secretions from mice with chronic gastric fistulae were studied before and after inoculation with toxigenic H. pylori or vehicle (saline). The area (7 mm²) of ulcers in control mice decreased gradually and disappeared almost completely after 14 or 28 days. The ulcers in H. pylori-infected mice were present at all test days, showing a larger area than in vehicle control animals. The GBF in control mice rose gradually with decreasing ulcer size, being significantly higher at the ulcer margin than the ulcer crater. In contrast, the GBF in H. pylori-infected mice was significantly lower at the ulcer area than that in the vehicle controls but, again, the GBF at the ulcer margin was always higher than at the ulcer crater. Gastric acid output was reduced by more than 50% immediately after H. pylori inoculation and was accompanied by a significant increase in plasma gastrin release and a fall in gastric luminal somatostatin content. These secretory changes persisted at all test days. Oedema/congestion of surface epithelium appeared after 7 days and mucosal inflammatory infiltration appeared after 14 days, to further increase after 28 days, upon the induction of ulcer. Plasma interleukin (IL)-Iß and IL-12 were significantly elevated above the initial values compared with controls. Conventional mice with gastric ulcers can be successfully infected with an H. pylori strain expressing cagA and vacA cytotoxin and this infection markedly delays healing of the ulcers, probably due to the fall in GBF in the ulcer area, mucosal inflammation, cytokine release and impairment of the gastrin-somatostatin link.     

端粒酶RNA与胃粘膜HpcagA及增殖细胞核抗原表达的关系

目的：探讨端粒酶RNA与胃粘膜幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A（HpcagA）感染及增殖细胞核原（PCNA）表达的关系。方法取病理证实的各种胃粘膜病变的活检标本150例，应用原位PCR及免疫组化ABC法分别检测端粒酶RNA、HpcagA感染和PCNA表达。结果HpcagA感染各组的PCNA、端粒酶RNA阳性率随着胃粘膜病变的加重而上升（P＜0．05）。HpcagA感染组PCNA、端粒酶RNA阳性率均高于未感染组（P＜0．05），其HpcagA核阳性与胃粘膜PCNSA及端粒酶RNA阳性表达呈显著正相关（r为0．747、0．671，P＜0．05）。结论HpcagA可通过刺激胃粘膜细胞过度增殖，使端粒酶RNA过度表达，而而启动及促进胃癌的发生发展过程。HpcagA核阳性可能是胃粘膜PCNA及端粒酶RNA阳性表达的机制之一。