O157大肠埃希菌食品分离株的特征研究

目的掌握福建省E.coliO157∶H7和O157∶H?食品分离株的毒力基因携带状况、PFGE分型特征、抗生素的药敏谱以及产志贺毒素的E.coliO157∶H7菌株的细胞毒性状况。方法分离菌株经VITEK全自动生化系统鉴定;O157和H7单克隆诊断血清凝集;PCR法检测O157、H7抗原基因及毒力因子基因;菌株的分型用PFGE方法进行;采用CLSI推荐的K-B法对菌株进行15种抗生素的药敏试验;对产志贺毒素的分离株用Vero细胞和Cyto Tox 96R○试剂盒进行细胞毒性检测。结果2株E.coliO157∶H7,其O157、H7及Stx2、Hly、eaeA毒力基因均阳性,Stx1基因均阴性;另3株E.coliO157∶H?,其O157基因阳性,H7和Stx1、Stx2、Hly、eaeA毒力基因均阴性;5株菌的PFGE带型各不相同,2株E.coliO157∶H7的同源性较高,达81%;菌株对15种常用抗生素较为敏感,链霉素、甲氧苄啶敏感率稍低为40%,其余敏感率达60%～100%。2株产志贺毒素的菌株对Vero细胞有毒性作用,细菌细胞比位50:1时细胞毒性百分比分别为61.25%和67.80%。结论本省在外环境动物性食品中存在产志贺毒素的E.coliO157∶H7菌株,提示应加强E.coliO157∶H7的监测,预防该菌在本省人间的感染和流行。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7（E.coliO157∶H7）脂多糖（LPS）抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖（O-SP）,并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。     

适配体捕获磁珠富集大肠埃希菌O157:H7方法的建立

目的建立一种低浓度大体积样品中快速捕获富集大肠埃希菌O157:H7的方法。方法利用链霉亲和素-生物素结合特性,将生物素标记大肠埃希菌O157:H7特异性适配体与链霉亲和素磁珠相结合,制备捕获磁珠,捕获样品中的大肠埃希菌O157:H7,通过平板培养计数法检测捕获效率。结果通过优化反应条件,建立的适配体捕获磁珠富集法在O157:H7低浓度样品(10~3cfu/ml)中捕获效率≥92.49%,大肠埃希菌O157:H7浓度10~1cfu/ml时捕获效率为96.08%,高浓度样品(10~7cfu/ml)中捕获效率≥56.52%,在模拟实际样品(牛奶、果汁、汽水)中捕获效率均≥70%,与PCR法结果一致。结论基于免疫磁珠技术建立的大肠埃希菌快速捕获富集方法,具有特异性强、灵敏度高操作简单、成本低廉等特点,在实际检测中具有良好发展前景。     

多重PCR方法检测大肠杆菌O157:H7的初步研究

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157：H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157：H7的O157抗原基因（rfbE基因）、鞭毛H7抗原基因（fliC基因）、粘附素基因（eaeA基因）和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因）为扩增对象，设计能导至目的片段大小不同的5对引物，通过优化条件，建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中，检测了5株不同来源的大肠杆菌O157：H7及27株非大肠杆菌O157：H7细菌。结果表明，该方法能从2株大肠杆菌O157：H7中扩增出rfbE、fliC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因，它们的大小分别为582bp、802bp、487bp、368bp和177bp。而另外3株大肠杆菌O157：H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157：H7，还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157：H7．除O149出现SLT-Ⅱ扩增产物和01：H7出现flic基因扩增产物外，其它非大肠杆菌O157：H7的扩增结果均为阴性，表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12h，用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu／g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性，可迅速、有效地将大肠杆菌O157：H7与其它非大肠杆菌O157：H7相区别，同时还能检测O157：H7中的毒力因子。因此，通过进一步研究，本方法有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

从同一份市售活鸡中检出E.coli O157∶H7和沙门菌的报告

E.coliO157∶H7和沙门菌均为致病菌,它们可以通过食物、水源污染和接触传播使人类感染致病或食物中毒,各国食品安全卫生指标对这些致病菌均规定禁止检出。近日,黄石市疾病预防控制中心中心实验室在进行食品污染物食源性致病菌的检测中,在市售的一份活鸡中同时检出了E.coliO157∶H7和沙门菌两种致病菌。现将有关情况报告如下:1材料与方法1.1样品来源黄石市某集贸市场销售的活鸡,采样号为D501.2培养基及试剂、诊断血清干燥培养基、细菌微量生化鉴定管购自北京陆桥技术有限责任公司;CHROMagar O157显色培养基和CHROMagar沙门菌显色培养…     

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（real-time PCR）技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。     

上海地区2006-2009年分离的大肠埃希菌O157特征分析研究

目的分析2006年至2009年在上海地区各监测点从病人、动物粪便及食品中分离的13株大肠埃希菌O157（E.coliO157）携带毒力基因的情况,分子分型特征及各菌株之间的相关性。方法利用聚合酶链反应（PCR）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术,结合生化鉴定、血清学分型的表型分析方法及Vero细胞毒性试验对上海地区分离的13株E.coliO157进行研究。结果 PCR结果显示有9株菌株的菌体抗原基因O157,鞭毛抗原基因H7及毒力基因stx2,hly,eaeA检测结果均为阳性,其中1株食品分离株的stx1基因检测结果也为阳性;9株菌均对Vero细胞有毒性作用。其余4株牛粪分离株,除O157基因检测结果为阳性外,其他检测结果均为阴性。13株上海分离株可分成6个PFGE型别。其中1株食品分离株与同样带有stx1基因的德国分离株的图谱最为接近;2株腹泻病人分离株属于同一PFGE型别;6株牛粪分离株的PFGE型别相同或高度相似。其余4株不携带毒力基因的牛粪分离株为不相关菌株。结论上海地区从病人、动物粪便和食品中都分离获得了能产生stx毒素的E.coliO157,提示需加强对该菌的监测。     

基因芯片检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7

目的设计和制备快速、特异、灵敏的检测大肠埃希菌O157∶H7基因芯片。方法选择O157∶H7特异的rfbE、fliC、SLT1和SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次聚合酶链反应(PCR)扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157∶H7菌株和非O157病原体。结果O157∶H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高。结论基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157∶H7,为建立快速灵敏的检测细菌病原体和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。     

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的 建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法.方法 根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测.结果 该方法扩增目的基因片段分别为327 bp、247 bp、494 bp、384bp和779 bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104 cfu/mL.结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测.     

多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157

目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合。其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16SrRNA。该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。     

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗出血性大肠杆菌Ο157∶H7(E.coliΟ157∶H7)特异性单克隆抗体(MAbs)。方法福尔马林灭活的E.coliΟ157∶H7免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术建立分泌抗E.coliΟ157∶H7MAbs的杂交瘤细胞株,对配对较好的6株MAbs用ELISA法测定其免疫球蛋白类及亚类,用ELISA法、凝集法和Westernblot鉴定MAbs的特异性。结果6株MAbs免疫球蛋白均为小鼠IgM。这些MAbs均能与27个E.coliΟ157∶H7菌株发生凝集反应,与部分弗劳地杆菌发生凝集反应,与11株鼠伤寒沙门氏菌、7株伤寒杆菌、2株痢疾杆菌、致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、出血性大肠杆菌Ο26∶H11和Ο111、肠集聚性大肠杆菌、42株非定血清型大肠杆菌、霍乱弧菌Ο1群和Ο139群不发生凝集反应;ELISA结果显示6株MAbs与粪链球菌、变形杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯杆菌均无交叉反应;ELISA和Westernblot结果显示,3株MAbs针对E.coliΟ157∶H77酚相脂多糖。结论6株MAbs具有较高的特异性,有可能用于制备检测E.coliΟ157∶H7的病原检测试剂。     

牛源大肠杆菌O157∶H7分离与鉴定及其毒力基因检测北大核心CSCD

目的研究新疆肉牛主产区健康牛群中该菌的携带情况及致病的可能性。方法对采自新疆伊犁昭苏县某牛场健康牛的85份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR技术和生化试验鉴定;对分离到的E.coli O157∶H7用PCR法检测其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因携带情况;用腹腔注射EC肉汤增菌原液的方法进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。结果 85份粪样中只鉴定出1株E.coli O157∶H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因;攻毒实验所有的小白鼠于24h内全部死亡。结论新疆伊犁地区牛群携带有E.coli O157∶H7,从所分离到菌株所携带的毒力基因情况和对小白鼠攻毒实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性。     

牛源大肠杆菌O157∶H7分离与鉴定及其毒力基因检测

目的研究新疆肉牛主产区健康牛群中该菌的携带情况及致病的可能性。方法对采自新疆伊犁昭苏县某牛场健康牛的85份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR技术和生化试验鉴定;对分离到的E.coli O157∶H7用PCR法检测其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因携带情况;用腹腔注射EC肉汤增菌原液的方法进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。结果 85份粪样中只鉴定出1株E.coli O157∶H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因;攻毒实验所有的小白鼠于24h内全部死亡。结论新疆伊犁地区牛群携带有E.coli O157∶H7,从所分离到菌株所携带的毒力基因情况和对小白鼠攻毒实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性。     

贵州省首次从腹泻病例中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 从贵州省1例腹泻病例的粪便标本中分离鉴定O157肠出血性大肠杆菌并对其进行毒力基因检测。方法 收集腹泻病例的粪便标本,mEC肉汤增菌后,采用O157胶体金进行初筛,阳性者增菌液经免疫磁珠富集后进行肠出血性大肠杆菌的分离,对分离株进行系统生化鉴定,O157、H7诊断血清凝集,应用特异性PCR进行rfbE和fliC基因鉴定,以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4种毒力基因检测。结果 腹泻病例粪便标本经mEC肉汤增菌后,检测O157胶体金阳性;增菌液经免疫磁珠富集后培养出可疑菌落,经系统生化鉴定为大肠杆菌,血清型为O157∶H7;PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因均阳性;毒力基因eaeA、stx2和hly均阳性,stx1阴性。结论 分离株确诊为肠出血性大肠杆菌O157∶H7,为贵州省腹泻病例中首株该病原体。     

应用多重PCR方法检测大肠埃希菌O157：H8的初步研究

目的 研究一种快速、特异的检测大肠埃希菌（以下称大肠杆菌）O157：H7的复合PCR方法。方法 选用针对大肠杆菌O157：H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ）和溶血素（Hly)基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157：H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果 除质粒缺失株（933）外,其余11株O157：H7大肠杆菌均在361bp处有溶血素基因产物出现;而12株O157：H8大肠杆菌扩增后的两条志贺样毒素基因产物存在差异,其中6株在210bp、484bp处出现两条相应产物,3株仅有210bp一条SLT－Ⅰ基因产物,另3株仅有484bp的SLT－Ⅱ基因产物。其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌的扩增结果均为阴性。结论 本复合PCR方法具有较高的特异性,可迅速、有效地将O157：H7大肠杆菌与其它常见致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌相鉴别,通过进一步研究有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157∶H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌和非O157:H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157∶H7。     

大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考耐药机制的初步研究

目的研究大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性产生的机制。方法本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将E.coli O157∶H7诱导成为氟苯尼考高度耐药菌株,采用无抗生素压力下连续传代培养或SDS方法将耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,使用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR,通过外排泵抑制剂与氟苯尼考联合使用,检测E.coli O157∶H7是否存在对氟苯尼考的主动外排作用。结果经过36代的耐药诱导,敏感菌株对氟苯尼考产生了高度耐药(MIC为256μg/mL)。质粒检测结果显示,耐药诱导菌株出现2个质粒,大小分别约为3 500bp和1 200bp,floR基因位于质粒DNA中。经连续传代培养或SDS法进行耐药消除,耐药诱导菌株对氟苯尼考的敏感性提高,但其质粒和floR基因均未丢失。结论 E.coli O157∶H7氟苯尼考敏感菌和耐药菌均存在对氟苯尼考的质子驱动型外排泵和ATP水解依赖型外排泵主动外排作用。     

出血性大肠杆菌O157菌壳的制备研究

目的利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备出血性大肠杆菌O157∶H7菌壳,鉴定其裂解效率并观察其形态。方法利用PCR技术扩增得到噬菌体PhiX174裂解基因E并克隆到质粒pBV220中,将重组质粒导入出血性大肠杆菌O157∶H7。重组菌株O157∶H7(pBV220::E)培养温度从28℃突升至42℃,每20min检测菌液OD600值,绘制重组菌株生长曲线。体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌壳结构。结果获得了PhiX174裂解基因E全长基因及重组质粒,构建了大肠杆菌的重组菌株。重组菌菌液OD600值在温度突升至42℃后40min后开始显著下降,80min后OD600值趋于平稳。细菌的裂解效率为98.4%。电子显微镜观察显示,经诱导后,O157∶H7细菌内容物可以通过细菌表面的孔道流出,从而形成菌壳。结论本研究成功制备了大肠杆菌O157∶H7菌壳,为将来进一步研究O157菌壳的特性奠定了基础。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。