成人侧脑室下区Nestin阳性细胞的免疫组化观察

目的　探讨成人侧脑室下区 (SVZ)Nestin阳性细胞的分布及其化学特点。方法　采用 3 3 1B、10C2、Rat4 0 1、GFAP、NSE和viminten等神经细胞标志物对成人SVZ区进行免疫组织化学研究。结果　SVZ区存在较多Nestin反应阳性细胞 ,GFAP免疫阳性细胞及较少的NSE免疫阳性细胞。Nestin免疫反应阳性细胞可分为两类 ,一类为卵圆形 ,胞体较大 ,少有纤维突起 ;一类为星形 ,胞体较小 ,发出多支放射状的纤维突起。Nestin免疫阳性细胞均不与GFAP及NSE发生交叉反应。成人SVZ区细胞未见有viminten的表达。结论　成人SVZ区可能存在神经前体细胞和星形胶质样Nestin免疫阳性细胞。     

出生前人脑齿状回颗粒细胞的梯度发育：钙结合素免疫细胞化学研究

为了探索人类齿状回颗粒细胞的出生前发育规律，用免疫细胞化学方法研究了１３～３８周人胎齿状回钙结合素（ＣＢ）阳性颗粒细胞的分布和发育。结果发现，在发育过程中，齿状回外肢的颗粒细胞最早表达ＣＢ，而内肢的颗粒细胞最晚表达ＣＢ；ＣＢ阳性颗粒细胞的数量及染色深度按先外肢后内肢的顺序逐渐增加。然而，ＣＢ阳性颗粒细胞的这种梯度分布在３８周时已不明显。本实验结果提示，出生前人脑齿状回各部位颗粒细胞并不是均匀地发育，而是呈现梯度发育     

胎儿海马内自分泌运动因子及其受体免疫反应阳性细胞的观察

为了观察自分泌运动因子及其受体在胎儿海马内的表达及分布特点,本研究应用免疫细胞化学技术显示胎儿海马内自分泌运动因子及其受体免疫反应阳性细胞。结果显示:17周时胎儿海马锥体细胞层内有自分泌运动因子及其受体的表达。随着胎龄的增长免疫反应阳性强度逐渐增强。提示自分泌运动因子及其受体可能参与海马锥体细胞层内细胞的迁移、发育等过程。     

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导，为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础。方法将胚胎干细胞（ESC）在成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增后脱离饲养层，让ESC自发分化成拟胚体（EB），再将EB诱导为巢蛋白（nestin）阳性的神经前体细胞（NPC），最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞（IPC）。结果ESC在MEF饲养层上扩增4d后，在悬浮培养状态下自发分化为EB。将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后，ESC先分化为上皮样细胞，再分化为神经细胞样细胞。经过nestin免疫组化检测，在经过NPC培养基诱导4d的细胞，nestin阳性细胞占86．5％。nestin阳性细胞在IPC选择性培养基中诱导5～6d后，可分化成胰岛素分泌细胞。结论ESC来源的nestin阳性细胞既可以分化为NPC，也可以分化为IPC。     

穹隆海马伞损伤诱导巢蛋白在隔-海马通路表达

目的:探讨穹隆海马伞横断后巢蛋白在隔-海马通路表达的情况。方法:在立体定位仪上横切SD大鼠大脑皮质、胼胝体和穹隆海马伞,于术后1～30 d处死动物。用免疫组化染色方法,观察损伤后巢蛋白在隔-海马通路的表达。结果:穹隆海马伞损伤后,第1天,隔区和海马未见巢蛋白阳性细胞;第3天巢蛋白阳性细胞开始出现在损伤近侧背外侧核区和海马CA3区及齿状回;第5天巢蛋白阳性细胞范围扩大,数量增加,出现在远离损伤平面嘴侧端的隔区和尾侧端的海马以及损伤对侧。第7天起,巢蛋白阳性细胞在损伤平面区减少而在远离区增加;第15天损伤对侧多于损伤侧;第20天消失。结论:穹隆海马伞横断引起隔-海马通路巢蛋白表达的改变,巢蛋白阳性细胞具有修复中枢神经系统病变的潜能。     

脑缺血再灌注后小鼠海马神经前体细胞的增殖

目的:研究小鼠脑缺血再灌注后海马神经前体细胞的增殖。方法:采用无创微动脉夹夹闭小鼠双侧颈总动脉0·5h的方法制作脑缺血再灌注动物模型。分正常对照组、假手术组、实验组小鼠脑缺血再灌注后1、3、5、7、14、21、28d组,共7个时相点。各组小鼠于各时相点处死前注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU)。处死后取出脑组织制备石蜡切片进行Nissl染色,BrdU免疫组织化学显色,观察脑组织缺血后的病理变化并比较缺血后不同时相点神经前体细胞增殖的差异。同时从小鼠心采血进行血气分析。结果:夹闭小鼠双侧颈总动脉的脑缺血再灌注模型可致PO2明显降低,PCO2明显升高,大脑皮质出现了缺血的形态学变化。小鼠海马BrdU 细胞在脑缺血再灌注后1d开始增加,7d达到高峰,28d恢复正常水平。结论:夹闭双侧颈总动脉是致小鼠脑缺血再灌注损伤的理想模型。小鼠脑缺血再灌注损伤能激活海马神经前体细胞的增殖,并在术后7d达峰值。     

巢蛋白的表达模式及其功能

巢蛋白 (Nestin)属于第Ⅵ类中间丝蛋白 ,主要由胚胎期和成年的神经前体细胞一过性表达 ,在中枢神经系统各种损伤条件下 ,脑中反应性星形胶质细胞和神经元又再现其表达。然而 ,本实验室首次观察到 ,在正常成年大鼠和成人基底前脑存在一个有别于胆碱能神经元的Nestin免疫反应阳性神经元簇 ,并证明了这些Nestin -IR神经元的Nestin表达受卵巢雌激素的影响。Nestin的功能与维持神经前体细胞的正常形态结构有关 ,也可能与其它的中间丝蛋白如神经丝共聚形成多聚体 ,此外 ,尚可能在影响其它蛋白的功能方面发挥作用。     

逍遥散对高浓度皮质酮环境下海马神经前体细胞增殖和分化的影响

目的：观察中药复方逍遥散（XYS）含药血清对高浓度皮质酮（CORT）环境下海马神经前体细胞增殖和分化的影响。方法:XYS由柴胡、当归、白芍、茯苓、白术、薄荷、煨生姜、甘草组成。采用体外无血清培养海马神经前体细胞,以120 μmol/L CORT建立高浓度CORT环境,制备XYS不同灌胃剂量含药血清,选取10%含药血清和10%血清,以CORT拮抗剂RU38486作为阳性对照药。MTT法检测海马神经前体细胞增殖率,BrdU和TUNEL免疫荧光双标、β-tubulin-Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）分别和TUNEL免疫荧光双标的方法检测海马神经前体细胞的增殖和分化。结果:120 μmol/L CORT能显著降低海马神经前体细胞的增殖能力（P<0.01）,RU38486能够逆转高浓度CORT所致神经前体细胞增殖率的下降（P<0.05）,10%XYS含药血清各剂量组均能显著增强神经前体细胞的增殖能力（P<0.05或P<0.01）。经高浓度CORT处理后,海马神经前体细胞BrdU/TUNEL染色荧光强度比值显著下降（P<0.01）,经RU38486和10%XYS含药血清各剂量组干预后,BrdU/TUNEL比值明显升高（P<0.01）。高浓度CORT环境下,海马神经前体细胞分化形成的神经胶质细胞和神经元的凋亡率明显提高（P<0.01）,RU38486及10%XYS含药血清各组均能明显抑制神经前体细胞分化形成的神经胶质细胞和神经元的凋亡（P<0.05或P<0.01）。结论:XYS能促进高浓度CORT环境下海马神经前体细胞增殖,抑制其分化形成的神经胶质细胞和神经元的凋亡,发挥抗应激时高浓度CORT损伤海马的作用。     

Nestin免疫阳性结构在正常成年大鼠脑内的分布及形态学观察

目的观察成年大鼠脑内Nestin免疫阳性结构的分布和形态学特征。方法采用免疫组织化学的方法 (ABC法)对成年SD大鼠脑切片进行Nestin免疫组化染色。结果在成年大鼠脑内基底前脑的隔斜角带复合体、Meynert基底核、视上核、室管膜区、室管膜下区、海马齿状回、CA1区、CA3区、正中隆起、穹窿下器、最后区处有Nestin免疫阳性结构的表达,形态有3种类型。结论成年大鼠脑内多处存在Nestin阳性结构的表达,形态多样,其化学属性和生物学意义有待进一步研究。     

人胚胎脑海马区神经前体细胞移植到损伤的成年大鼠脑内存活及迁移的研究

本文从人胚胎脑海马区分离、培养、鉴定了神经前体细胞(neuralprecursorcells,NPCs),并初步观察了大鼠纹状体海人酸(kainicacid,KA)损伤后,人神经前体细胞(hNPCs)移植到成年大鼠侧脑室和纹状体后存活和迁移的情况。取胎龄8~12周的人胚胎脑海马区细胞,用含人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor,h-EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(humanbasicfi-broblastgrowthfactor,h-bFGF)以及人白细胞抑制因子(humanleukemiainhibitorygrowthfactor,h-LIF)的DMEM/F12培养液离体培养,以含1%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的DMEM/F12诱导分化,巢蛋白(nestin)免疫荧光染色鉴定NPCs的特征。向成年大鼠右侧纹状体内立体定位注射KA,造成大鼠纹状体局部损伤。用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)体外标记第2代hNPCs,48h后分别移植到正常成年大鼠和损伤大鼠手术侧的侧脑室和纹状体。6周后用抗BrdU抗体检测HNPCs的存活和迁移。结果显示:体外培养呈悬浮球状生长的细胞是nestin阳性的hNPCs。hNPCs移植6周后,在大鼠损伤侧的纹状体和侧脑室内,均检测到了BrdU阳性细胞,并有一部分细胞迁移到了周围纹状体实质和胼胝体。结果提示:体外分离培养的hNPCs移植到成年大鼠脑损伤区周围可以存活和迁移,损伤区域可能对移植细胞的迁移有一定的诱向作用。     

人胎海马生长抑素和神经生长因子免疫阳性神经元的研究

本文采用免疫细胞化学ABC法对20例胎龄为16～36周的人胎儿海马进行了观察。证明人胎海马存在着生长抑素和神经生长因子免疫阳性神经元，两者均散在分布于海马皮质的深层，为多极神经元；免疫反应阳性颗粒均匀地分布于神经元胞质中，生长抑素阳性细胞中的颗粒比神经生长因子阳性细胞中的颗粒粗大。本文结果提示：人胎海马中存在的上述两类阳性神经元可能在中枢神经系统的发育中起着重要作用。     

成人基底前脑巢蛋白免疫阳性神经细胞的细胞化学观察

目的 探讨巢蛋白(nestin)免疫阳性细胞在人基底前脑内的分布规律及化学特性。方法 采用nestin331B、10C2、Rat 401抗体显示人基底前脑的nestin免疫阳性细胞，并应用NSE、p75NGFR、ChAT、GFAP抗体分别对nestin免疫阳性细胞进行了双标免疫细胞化学研究，同时还应用NADPH-d进行组织化学染色。结果 在成人基底前脑有一个连续的nestin免疫阳性细胞带，胞体较大，呈卵圆形或梭形，有1～3个突起，分布于隔核、斜角带核、Meynert核、无名质及杏仁核群。双标染色显示，nestin阳性细胞被NSE抗体标记，并与ChAT、NGFR、NOS阳性神经元间杂分布，多数不呈交叉反应。约28％nestin免疫阳性细胞为ChAT阳性神经元，15％为NGFR阳性神经元，6％为NOS阳性神经元。此外，透明隔及隔区靠近软膜处有少量nestin免疫阳性细胞，其形态与星形胶质细胞相似，不与GFAP有交叉免疫阳性反应。结论 成人基底前脑存在一个有别于ChAT、NGFR、NOS神经元的nestin免疫阳性神经元簇，其生物学意义值得进一步研究。     

人胎儿海马发育的初步观察

取4—10个月的人胎儿海马中段,作沿长轴横切片,Nissl法染色后,观察其发育过程中锥体细胞最的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞的变化。结果发现随着海马的发育,细胞的密度变小,体积变大,并且这种变化有快慢交替的情况。     

成年大鼠基底前脑隔-斜角带复合体的巢蛋白免疫阳性神经元至海马的纤维投射

目的 观察大鼠基底前脑巢蛋白(nestin)免疫阳性神经元的纤维投射。方法 先用荧光素逆行追踪法显示基底前脑内投射至海马的荧光素标记神经元，观察摄片后再进行nestin免疫组织化学染色。对比荧光照片和免疫组织化学染色照片，辨认荧光素和nestin双标神经元。结果 在基底前脑注射侧的内侧隔核(MS)和斜角带核的垂直支(vDB)和水平支(hDB)均存在荧光素标记细胞，其中一部分为nestin免疫阳性。在MS、vDB和hDB，双标细胞占逆行标记细胞的比例分别为21．3％、25％和20．6％；占nestin阳性细胞的比例分别为26．6％、15．7％和16．3％。结论 大鼠基底前脑的nestin免疫阳性神经元发出神经纤维向海马投射。提示在基底前脑有一个平行于隔-海马胆碱能投射和GABA能投射的第3条通路。     

巢蛋白在成年C57小鼠和SD大鼠中枢神经系统中的分布及比较

目的 观察巢蛋白(nestin)在成年C57小鼠和SD大鼠中枢神经系统中的分布,探讨并比较神经干细胞在两种啮齿类动物中分布的异同。方法 采用免疫组织化学ABC法和间接免疫荧光法,显示含神经干细胞特征性的标志物巢蛋白的阳性结构在上述两种啮齿类动物中枢神经系统中的分布。结果 在成年C57小鼠中枢神经系统中,巢蛋白在整个脑室系统周围均有表达,免疫阳性结构位于室管膜细胞胞体及其突起,并呈现由吻端向尾端渐次减少的趋势。在成年SD大鼠的脑室系统中,巢蛋白主要分布在侧脑室外侧壁及其周围脑区。此外,在两者的齿状回、穹窿下器、最后区等脑结构中也有巢蛋白的表达。成年C57小鼠中枢神经系统中巢蛋白的表达,无论在免疫阳性结构的数量上还是在染色强度上都明显多于和强于成年SD大鼠。结论 巢蛋白在成年C57小鼠中枢神经系统中的广泛脑区均有表达,而在成年SD大鼠中仅见于有限的脑区,提示成年C57小鼠中枢神经系统可能具有较强的神经可塑性和损伤修复能力。     

胎儿(36—40周)纹状体和下丘脑NPY免疫反应神经元的分布

本文用免疫细胞化学ABC法研究胎儿(36—40周)纹状体和下丘脑NPY免疫反应神经元的分布。在胎儿的纹状体发现尾状核和壳含有许多NPY免疫反应神经元的胞体和纤维。这两个区域的一些血管壁内也含有NPY免疫反应神经元的胞体和纤维。胎儿下丘脑的漏斗核和视上核含密集的NPY免疫神经元胞体,在室旁核偶尔也可见到少数免疫神经元胞体。本文首次报道了尾状核和壳的血管壁内及视上核含有NPY免疫反应神经元胞体。     

成人骨骼肌细胞原代培养

本研究以获取基因治疗自体移植的载体为目的 ,观察了生长因子对成人骨骼肌卫星细胞增殖的影响。用手术中取得的成人骨骼肌进行体外组织块培养及酶消化培养 ,用成纤维细胞生长因子及表皮生长因子进行处理 ,作动态观察。结果证明 ,消化分离出的肌卫星细胞数量极少 ,培养不能成活 ;组织块培养肌卫星细胞的增殖与生长因子的作用有关 ,成纤维细胞生长因子及表皮生长因子处理组的增殖细胞数显著高于对照组。提示 ,生长因子可促进成年人骨骼肌卫星细胞增殖 ,但与其年龄及部位有一定关系。     

海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞迁移的作用

为了探讨切割海马伞后的海马和正常海马在蛋白表达方面的差异,获取海马中具有生物活性的特异蛋白,并观察其对人胚神经干细胞迁移的影响,取切割SD大鼠海马伞后10、14、20d及正常海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d海马和正常海马的56kD差异蛋白胶条及空白对照胶条共培养,观察神经干细胞球中神经干细胞迁移情况,第3d时计数朝胶条方向1/4扇区内的迁出细胞数。结果显示,切割后各天组和正常组比较见多条差异蛋白条带,其中56kD差异蛋白的密度积分正常组最低,10d组和20d组较高,14d组最高。神经干细胞球中向56kD差异蛋白胶条方向迁移的细胞数在切割组最多,正常组次之,对照组最少。提示切割海马伞后的海马与正常海马间存在多种差异蛋白,其中56kD蛋白在切割海马伞后14d表达量最高,并具有诱导神经干细胞迁移的作用。