PCR和分离培养检测细胞培养支原体污染的比较

目的：检测细胞培养中支原体的污染,建立支原体通用的ＰＣＲ方法。方法：根据已出版的序列设计并合成一对支原体（柔膜体纲）１６ＳｒＲＮＡ基因组特异引物。对实验室所存的１２种支原体、大肠杆菌、变形杆菌及无支原体污染的组织培养细胞进行了ＰＣＲ扩增。以ＰＣＲ与分离培养比较检测了３３份细胞培养标本。结果：１２种支原体均出现了约６２０ｂｐ左右的特异性扩增带,敏感性为１００～１０００个支原体细胞,且常见的６种细胞培养污染支原体的扩增片段均能被ＨｉｎｄⅢ切成２８０与３４０ｂｐ左右的２条带。理论上推测这对引物可扩增所有支原体１６ＳｒＤＮＡ。但对大肠杆菌、变形杆菌及无支原体污染的组织培养细胞等未见有扩增带出现。在对３３份细胞培养标本的检测中,除ＰＣＲ和分离培养同时检出２份阳性外,前方法还另检出阳性３份。５份ＰＣＲ扩增物均被ＨｉｎｄⅢ切出２条带。结论：ＰＣＲ较分离培养敏感性高,可提高细胞培养污染支原体的检出率,防止出现假阴性结果;如做好质量控制,对于一般实验室检测细胞培养支原体污染,ＰＣＲ扩增较分离培养具有更大的应用意义     

16SrRNA基因PCR对新生儿败血症的诊断研究

目的：探索快速可靠的新生儿败血症诊断的新方法。方法：通过自行设计合成细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物，对２０种标准菌株、１２种２７株临床分离细菌基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行ＰＣＲ扩增。结果：细菌具有３７１ｂｐ扩增产物，与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应，ＰＣＲ最低能检测１ｐｇ大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增诊断败血症病原菌的方法，检测快速，特异性、敏感性高。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

细胞培养过程中支原体污染的检测及预防

目的对细胞培养过程中的支原体污染进行检测并探讨相应的预防措施。方法通过DNA荧光染色和聚合酶链反应(PCR)来检测细胞培养过程中的支原体污染,分别对有支原体污染细胞、未污染细胞、小牛血清及培养基进行了实验研究。结果支原体污染细胞能被Hoechst 33342染色且PCR产物在280 bp处有特异性阳性条带。结论通过两种实验方法联合检测为判断细胞是否为支原体污染提供准确依据,并能对支原体污染做出相应预防措施。     

应用套式聚合酶链反应检测母婴垂直感染乙型肝炎的研究

目的：为准确、迅速诊断乙型肝炎，本研究在１１３例母婴血清标本中建立套式ＰＣＲ检测技术并与ＰＣＲ方法进行比较。方法：应用套式聚合酶链（ＰＣＲ）法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ１１３例。结果：１１３例孕妇，第一对引物ＰＣＲ扩增１０１例阳性，第二对引物ＰＣＲ扩增９７例阳性。７７例为乙肝的婴儿，第一对引物ＰＣＲ扩增６９例阳性，第二对引物ＰＣＲ扩增６５例阳性。二对引物经套式ＰＣＲ，孕妇又有１２例阳性，其中阳性率提高８．８５％，婴儿有８例阳性，阳性率提高７．８％。结论：套式ＰＣＲ比ＰＣＲ方法更快、更敏感、更特异、更简便，直接支持了母婴垂直感染的论点     

一种简便快速制备多聚酶链反应模板的方法

在多聚酶链反应时采用一种快速简便的模板ＤＮＡ制备方法。组织块在冰浴中剪碎和匀浆，再用蛋白酶Ｋ降解；细胞则直接用蛋白酶Ｋ处理。离心后，取上清则可直接作为ＰＣＲ的模板。采用此方法制备的模板，经ＰＣＲ扩增，检测宫颈细胞、细胞培养物、口腔肿瘤活检组织中ＨＰＶ６、１１和ＨＳＶ的感染，取得了满意的结果。揭示该方法能从各种细胞和组织中制备ＰＣＲ的模板，而无需用ＳＤＳ－苯酚－氯仿抽提ＤＮＡ。     

逆转录—半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究，方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性，特异性及临床应用研究。结果所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测为阴性，８６份级ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血     

培养基培养法和细胞培养法分离培养生殖支原体的初步探讨

目的：用培养基培养法和细胞培养法分离培养临床标本中的生殖支原体（Mg),以证实天津地区性传播疾病（STD）门诊患者有无Mg感染。方法：用无菌棉拭子取STD门诊患者生殖泌尿道分泌物,分别接种于SP-4培养基和Vero细胞进行Mg的分离培养,对符合Ｍg培养特性的培养物,用套式ＰＣＲ试验、代谢抑制试验以及ＰＣＲ扩增产物核酸序列测定等方法进行鉴定。结果：采用培养基培养法自７９名ＳＴＤ门诊患者中分离培养出２株Ｍg,分离率为２.53%。结论：首次同时应用培养基培养法和细胞培养法从临床标本中分离培养出Mg菌株,从病原学上证实天津地区STD患者中存在Mg感染。     

PCR早期诊断支原体肺炎105例结果分析

采用肺炎支原体－－聚合酶链反应（ＭＰ＝ＰＣＲ）试剂盒及血冷凝集试验检测１０５例住院肺炎患儿。结果，ＭＰ－ＰＣＲ最性２９例，阳性率２７．６％；－１２岁年龄组阳性率高于－３岁年龄组。ＭＰ－ＰＣＲ阳性患儿的入院前病程显著长于ＭＰ－ＰＣＲ阴性患儿。血冷凝集试验滴度≥１：３２的３２例中，ＭＰ－ＰＣＲ阳性１６例。１２名正常儿童ＭＰ－ＰＣＲ检测均阴性。表明ＰＣＲ检测对ＭＰ肺炎具有早期确诊价值，而血冷凝集试验对Ｍ     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌

目的：建立双重ＰＣＲ技术快速鉴定的结核与非结核分支杆菌。方法：通过试验选择双重ＰＣＲ最佳反应条件,检测引物Ａ１,Ａ２和Ｂ１,Ｂ２扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对３４例结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果：引物Ａ１,Ａ２能扩增所试２４种分支杆菌,Ｂ１,Ｂ２仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增１２种非分支杆菌均为阴性。     

结核分枝杆菌耐药基因检测

目的：研究结核分枝杆菌耐药的分子机制，建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应、ＰＣＲ－单链构象多态性、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性分析ＭＴ临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ＫａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果：ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－１０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ经物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的种特异性。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ与Ｐ     

西安地区274例泌尿生殖道感染患者中生殖支原体感染分析

目的 了解西安地区人群泌尿生殖道感染患中生殖磕原体（Ｍｇ）的感染现状。方法 从西安地区性病门诊收集２７４例有泌尿生殖道症状患的标本,以支原体属特异性引物通过多聚酶链反应（ＰＣＲ）进行初步筛选,阳性标本进一步以生殖支原体特异性引物作ＰＣＲ检测。结果 ２７４例有泌尿生殖道症状患中,支原体属特异性引物扩增阳性患３０例,阳性率为１１％,进一步以Ｍｇ特异性引物对３０例标本进行ＰＣＲ检测,阳性患１０     

小儿肺炎支原体感染的早期诊断

探讨小儿肺炎支原体感染的早期诊断方法。方法：对３８５例呼吸道感染的住院患儿应用聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术检测咽拭子肺炎支原体ＤＮＡ，同时行血冷凝集试验（Ｃｏｌｄａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔ，ＣＡＴ），进行配对资料研究。结果：不同年龄患儿呼吸道感染肺炎支原体发病情况有所不同。ＰＣＲ法检测肺炎支原体ＤＮＡ阳性率不受自然病程的影响，ＣＡＴ法检测阳性率则明显受到病程的影响。ＰＣＲ法阳性率为３８．１８％，ＣＡＴ法阳性率为１１．６９％，差异有极显著性意义。结论：咽拭子ＰＣＲ法检测肺炎支原体ＤＮＡ，不受病程、年龄因素的影响，具有特异、快速、敏感、标本易于采集等优点。     

巨噬细胞吞噬法消除培养细胞的支原体污染

支原体污染一直是细胞培养的大敌。随着细胞培养日益成为很多实验室常用重要实验手段,对支原体污染的防治目前显得十分迫切。多年来虽然也有许多救治支原体污染的方法,但效果好而易行的甚少,本文介绍一种用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬法处理支原体污染细胞的方法,我们用此法救治受支原体严重污染的细胞,收到了满意的效果。     

检测人巨细胞病毒的免疫—PCR方法的建立

目的：依据免疫－ＰＣＲ基本原理，建立检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）活动性感染的免疫＿ＰＣＲ方法。方法：我们建立的免疫－ＰＣＲ方法与酶联免疫ＥＬＩＳＡ不同之处是，用ＰＣＲ扩增生物素化线性ＰＢＶ２２０ＤＮＡ代替ＥＬＩＳＡ的酶催化底物，经琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色观察分析扩增产物异条带，判断结果。结果：用本法检测ＨＣＭＶ的敏感性高于ＥＬＩＳＡ法１０＾３－１０＾５倍，可检测到５个感染ＨＣＭＶ细胞；而检测ＨＳ     

用Ciprofloxacin和BMcyclin清除培养细胞的支原体污染

防治支原体污染是细胞培养中难以解决的问题，我们用ＣＩＰ和ＢＭｃｙｃｌｉｎ联合治疗清除了杂交瘤细胞ＨＡｂ１８，Ａ１０，骨髓细胞ＳＰ２／０和人白血病细胞Ｋ５６２中的支原体污染。方法：３株小鼠细胞系（ＨＡｂ１８，Ａ１０，ＳＰ２／０）用含有１０μｇ／ｍｌＣＩＰ培养液治疗１２ｄ后根除了污染的支原体。人细胞株（Ｋ５６２）用ＣＩＰ加ＢＭｃｙｃｌｉｎ联合治疗２６ｄ后清除了支原体的污染。结果：清除支原体后，细胞的增     

用Ciprofloxacin和BMcyclin清除培养细胞中的支原体污染

目的：防治支原体污染是细胞培养中难以解决的问题．我们用ＣＩＰ和ＢＭｃｙｃｌｉｎ联合治疗清除了杂交瘤细胞ＨＡｂ１８，Ａ１０，骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人白血病细胞Ｋ５６２中的支原体污染．方法：３株小鼠细胞系（ＨＡｂ１８，Ａ１０，ＳＰ２／０）用含有１０μｇ／ｍｌＣＩＰ的培养液治疗１２ｄ后根除了污染的支原体．人细胞株（Ｋ５６２）用ＣＩＰ加ＢＭｃｙｃｌｉｎ联合治疗２６ｄ后清除了支原体的污染．结果：清除支原体后，细胞的增殖率和杂交瘤细胞抗体分泌稳定性增强．未见有任何毒性作用．结论：用ＣＩＰ和ＢＭｃｙｃｌｉｎ清除培养细胞中支原体的污染是一个安全有效的方法．     

用巢式多聚酶链反应检测细胞培养中污染支原体方法的建立

细胞培养技术已经成为生物学和医学研究的重要工具,而细胞培养中支原体污染已是极严重的问题。而应用已被支原体污染的培养细胞或组织进行生物学和医学研究,必将导致错误结果。本文用三个引物(F1、F2及R1),建立巢式多聚酶链反应(nested PCR)方法,选择性扩增16s-23srRNA间区序列,并对其通用性、特异性、灵敏性进行鉴定。该法具有五大特点: 1.通用性常见污染细胞培养的支原体有精氨酸支原体、口腔支原体、人型     

肺炎患儿肺炎支原体感染的实验室检测

目的：探讨肺炎患儿肺炎支原体（ＭＰ）感染的实验室检测方法。方法：使用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测６７６例肺炎患儿ＭＰ的感染,其中１３９例同时采用支原体培养进行检测;１１２例做间接血凝试验（ＩＨＡ）。结果：ＰＣＲ法对ＭＰ感染的检出率明显高于培养法（Ｐ〈０．０１）,双份血清ＩＨＡ的检测率和ＰＣＲ法比较无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,单份血清ＩＨＡ的检出率明显低于ＰＣＲ法（Ｐ〈０．０１）。结论：ＰＣＲ法     

肝癌外周血AFP mRNA的测定及意义

目的 建立一种灵敏的巢式逆转录聚合酶链反应法（ＲＴ－ＰＣＲ）,用于检测外周血中的ＡＦＰ ｍＲＮＡ。方法 将患者分成四组：原发性肝细胞癌组３８例,慢性肝炎组９例,肝炎后肝硬化组１２例,正常对照组１０例。通过采肝素抗凝外周血、分离单个核细胞、抽提ＲＮＡ、逆转录合成ｃＤＮＡ、设计ＡＦＰ基因引物来进行巢式ＰＣＲ扩增。 结果 所有正常人外周血中ＡＦＰｍＲＮＡ全部阴性,原发性肝细胞癌组的外周血中ＡＦＰ ｍＲＮ