脑肿瘤二级康复预防：阳离子脂质体介导HSV-TK／ACV系统对人脑胶质瘤细胞增殖活性的影响

背景:基因治疗是国内外对于脑胶质瘤生物学治疗的研究热点.目的:应用已克隆并构建的真核表达载体pCR3-TK,探讨HSV-TK/ACV系统对人脑胶质瘤细胞抑制生长和杀伤作用研究.设计:以细胞为研究对象的实验研究.单位:一所大学医院神经外科、肿瘤内科.对象:实验于2004-01/04在哈尔滨兽医研究所生物技术国家重点实验室完成.所用的真核表达载体pCR3-TK由作构建,TJ905细胞株由天津神经病学研究所浦佩玉教授惠赠.选择未转染和转染空载体的细胞作为对照组.方法:用阳离子脂质体Lipofectamine将pCR3-Uni及含HSV-TK基因的真核表达载体pCR3-TK转染至人脑胶质瘤细胞株TJ905中,筛选出阳性克隆,阳性细胞克隆给予ACV(50 mg/L),72 h后,收集玻片,进行AgNOR染色.主要观察指标:对未转染和转染不同载体的TJ905细胞ACV作用后银染颗粒进行记数.结果:转染HSV-TK基因的细胞,在给予ACV后,细胞增殖活性明显降低,转染pCR3-Uni和pCR3-TK细胞克隆的AgNOR颗粒数分别为14.33和6.67(P＜0.01).结论:AgNOR计数是一种操作简便、检测细胞增殖活性的方法,为研究HSV-TK/ACV系统的抗肿瘤机制提供帮助.     

脂质体法pcDNA3-TK质粒转染胶质瘤细胞C6

目的:构建含有tk基因的真核表达载体,并转染C6细胞株建立其表达系统,为探索胶质瘤的基因治疗奠定实验基础.方法:通过酶切pSNAV2.0-TK和pcDNA3分别获得目的基因tk片段及pcDNA3片段,将目的基因插入载体相应的酶切位点,构建pcDNA3-TK质粒.酶切鉴定后采用脂质体法瞬时转染C6细胞,RT-PCR检测tk基因在细胞中的表达.结果:pcDNA3-TK质粒构建成功并顺利导入C6细胞中.结论:构建的pcDNA3-TK质粒能够在转染的C6细胞中稳定、持续和高效地表达.     

HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确。结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础。     

Livin靶向si-RNA对胶质瘤TJ 905干细胞及肿瘤坏死因子α的影响

目的：从人脑胶质瘤TJ905细胞中分离肿瘤干细胞,制作livin基因干扰模型 si-RNA livin,探讨livin靶向 si-RNA对TJ905干细胞增殖及肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达的影响。方法 TJ905细胞经免疫磁珠法分离获取肿瘤干细胞,构建干扰 livin基因 si-RNA,通过慢病毒转染干细胞建立干扰组,另设对照组转染空病毒,利用替莫唑胺（TMZ）干预,观察肿瘤干细胞的形态学改变,Cell Counting Kit-8（CCK8）法检测细胞增殖,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测 livin、TNF-α的表达。结果成功制作慢病毒转染 TJ905干细胞 livin靶向 si-RNA 模型。干扰组TJ905干细胞增殖活性及 livin的表达较对照组显著降低（P＜0．01）。相同药物浓度下干扰组 TNF-α的表达显著高于对照组（P ＜0．05）。结论 Livin 靶向 si-RNA 可能通过上调 TNF-α基因的表达,并促使化疗药物TMZ对干细胞TNF-α的表达产生诱导作用,最终降低了干细胞的化疗耐药。     

新靶点细胞周期蛋白E干扰RNA对人脑胶质瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨新靶点细胞周期蛋白E干扰RNA对人脑胶质瘤细胞的增殖及侵袭转移能力的影响。方法构建4个新靶点的Cyclin E干扰RNA的真核表达载体作为实验组（1至4组）,同时设立U251人脑胶质瘤细胞为对照组（U251组）。对实验组用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否,转染载体到胶质瘤U251细胞株,通过RT-PCR的结果检测转染后Cyclin E mRNA表达量。对实验组及U251组用M1rr法检测细胞增殖能力的变化,用Transwell小室法检测侵袭能力的变化。结果分别构建了4个新靶点的Cyclin E干扰RNA真核表达载体,CyclinEmRNA表达明显受到抑制（P均〈0．05）,其中实验1组细胞与U251组相比增殖及侵袭能力减弱（P均〈0．05）。结论新靶点Cyclin E干扰RNA使Cyclin E表达下调,从而导致人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭能力减弱。     

人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的 克隆人CD13全长cDNA,构建稳定表达人CD13 分子的基因转染细胞株.方法 提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR 克隆人CD13基因,将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term.将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD13 和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞.结果 成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/ CD13,并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929/CD13.结论 成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体,成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株,为研究CD13生物学功能奠定了基础.     

慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞的实验研究

目的 探讨HIV-1来源的慢病毒载体介导红色荧光蛋白(RFP)基因转染人脑胶质瘤干细胞可行性和试验方法.方法用无血清干细胞培养基培养人脑胶质瘤干细胞,然后用细胞免疫荧光染色检测其干细胞特性表面标志物CD133、Nestin表达情况.以HIV-1来源的慢病毒为载体,以RFP基因为目的 的基因转染人脑胶质瘤干细胞,荧光显微镜下观察RFP阳性细胞表达情况及其转染率.MTT法检测转染后细胞与未转染RFP细胞组细胞增殖情况.再次用细胞免疫荧光染色检测转染后脑胶质瘤干细胞表面标志物CD133、Nestin表达情况.结果 红色荧光慢病毒转染胶质瘤干细胞体外连续培养后,RFP在干细胞中稳定表达,在荧光显微镜下即发出红色荧光,并且转染效率高.RFP- lentivirus转染后干细胞与未转染RFP组比较,生长曲线无明显差异,且转染后干细胞表面标志物仍表达阳性.结论 采用HIV-1来源的慢病毒载体介导以RFP基因为生物标记物标记人脑胶质瘤干细胞是可行的,以慢病毒转染对干细胞的生长影响小,转染效率高.     

sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究

目的构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对C6胶质瘤细胞的抑制作用。方法通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL。以阳离子脂质体介导转染C6胶质瘤细胞并用流式细胞仪观测对细胞增殖的影响。结果经过测序鉴定和蛋白表达检测证实,重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质体介导质粒转染C6胶质瘤细胞阳性率达50%。脂质体PcDNA-sTRAIL转染C6细胞后,相比未转染、空质粒转染、Lipofectin转染组C6胶质瘤细胞增殖抑制、细胞凋亡明显增加（t分别=9.52、7.20、2.84,P均〈0.05）。结论成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体,并从体外实验中初步证实了其对C6胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

人B7-H3两种异构体基因转染细胞株的建立及对T细胞协同刺激作用的比较

目的 建立2IgB7-H3基因转染细胞株和4IgB7-H3基因转染细胞株,探讨B7-H3两种异构体对T细胞的协同刺激作用.方法 RT-PCR 法从诱导成熟的DC细胞中克隆人B7-H3两种异构体基因2IgB7-H3和4IgB7-H3的编码区,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体构建pIRES2-EGFP/2IgB7-H3和pIRES2-EGFP/4IgB7-H3重组子,采用脂质体法转染脑胶质瘤细胞株SHG44.经G418抗性筛选,采用免疫荧光标记和流式细胞术分析2IgB7-H3和4IgB7-H3在SHG44细胞上的表达.继而,利用MTT法和酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析两种异构体基因转染细胞株对T细胞体外增殖和细胞因子的分泌.结果 成功构建了可以稳定表达2IgB7-H3和4IgB7-H3的基因转染细胞株.体外生物学功能分析表明,与转染空载体的SHG44/mock细胞相比,SHG44/2IgB7-H3和SHG44/4IgB7-H3均能有效抑制T细胞增殖以及对IFN-γ的分泌,且两者的协同抑制作用不存在显著差异.结论 B7-H3两种异构体分子均能负性调控T细胞介导的免疫应答,但两者的生物学功能并不存在显著的差异.     

大鼠组织因子基因克隆及其在C6细胞系中的表达

目的:克隆大鼠组织因子(tissue factor,TF)基因,构建真核表达载体pEGFP-N1-TF,转染C6大鼠神经胶质瘤细胞并检测转染细胞内TF表达水平.方法:采用RT-PCR法从Wistar大鼠肺组织中扩增TF基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1上.通过测序鉴定重组质粒中插入TF的完整性和可靠性.应用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转入C6细胞中,荧光显微镜下观察EGFP报告基因的表达强度和转染效率,并对转染细胞的TF-eGFP融合蛋白进行Western blot检测.结果:成功构建pEGFP-N1-TF真核表达载体,转染C6细胞24 h后,在荧光显微镜下可以观测到荧光,并通过Western blot技术检测到TF-eGFP融合蛋白的表达.结论:重组真核表达载体pEGFP-N1-TF构建成功,转染C6细胞后获得了良好的瞬时表达.     

HBVe抗原的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有HBV e抗原基因的pcDNA3真核表达载体,并在BEL7402肝癌细胞中表达与鉴定.方法 设计合成针对e基因片段的PCR引物序列,以pUC19/3HBV为模板扩增出HBeAg基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3的多克隆位点中,构建pcDNA-HBeAg真核表达载体.然后采用脂质体转染法将其转染人肝癌细胞系BEL7402肝癌细胞,分别运用逆转录PCR和ELISA在RNA水平和蛋白水平检测其在真核细胞中的表达.结果 所克隆HBV e抗原基因片段经测序完全正确;重组质粒转染BEL7402细胞后,检测有HBeAg表达.结论 成功构建pcDNA3-HBeAg真核表达载体,并在肝癌细胞中有效表达,为进一步体外研究HBeAg奠定基础.     

促红细胞生成素小干扰RNA真核表达载体的构建

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)新靶点的小干扰RNA (siRNA)真核表达载体构建策略.方法 设计合成3个EPO siRNA片段,与含有绿色荧光蛋白和卡那霉素抗性的质粒载体连接,转化到JM109大肠埃希菌感受态细胞中,采用碱基序列测序方法鉴定其构建情况.在人脑神经胶质瘤U251细胞株中,转染成功构建的3个EPO siRNA真核表达载体,采用倒置荧光显微镜,观察U251细胞绿色荧光蛋白表达情况.结果 ①本研究成功构建了新靶点EPO siRNA真核表达载体,即PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3,并且构建的3个EPO siRNA真核表达载体序列,与所设计的标准序列完全相同,未发现任何突变、缺失、插入等基因异常情况.②本研究成功将3个EPO siRNA真核表达载体PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3转染至人脑神经胶质瘤U251细胞内,并且所有转染PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3的U251细胞均表达绿色荧光蛋白.结论 本研究成功构建新靶点EPO siRNA真核表达载体,并将其转染于人脑神经胶质瘤细胞中,为EPO在贫血等疾病中的作用机制研究奠定了实验基础.     

人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中NOTCH-1信号通路的调控

背景:研究发现NOTCH-1信号通路在神经干细胞或种经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用.目的:探讨NOTCH-1信号通路在人脑胶质瘤干细胞增殖和分化过程中的调控作用.设计、时间及地点:开放性实验,于2005-01/2007 03在解放军第三军医大学新桥医院完成.材料:人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织由解放军第三军医大学新桥医院神经外科提供.U251胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学新桥医院神经外科吕胜青副教授惠赠:CHG-5胶质瘤细胞株由解放军第三军医大学西南医院病理研究所卞修武教授、姚晓红博士惠赠.方法:取人脑胶质瘤组织、正常成人脑组织、U251及CHG-5胶质瘤细胞株,采用免疫磁珠法分选获得CD133+脑胶质瘤干细胞,加入DMEM/F12无血清培养基进行增殖培养,形成细胞克隆后,加入含体积分数为10%胎牛血清的培养液,2 h后行抗CD133和抗巢蛋白免疫荧光双标染色.主要观察指标:人脑胶质瘤十细胞的生长和鉴定,采用WST-8法、免疫组化实验、流式细胞仪、免疫荧光双标实验检测NOTCH-1信号通路蛋白的表达.结果:在无血清培养基中,细胞呈悬浮生长,培养24～48 h可见单个细胞开始分裂生长,形成肿瘤球,将肿瘤球转入含胎牛血清的培养基后,4 h周边细胞伸出突起并逐渐分化,24 h后肿瘤球迁移出的细胞增多,形成单细胞层.肿瘤球能同时表达干细胞标志物CDl33和巢蛋白,CD133脑胶质瘤干细胞核浆比例达2/3～3/4,突起少,胞浆中线粒体等细胞器较少,核糖体丰富,未见胶质丝等分化结构,符合干细胞超微结构特点.NOTCH-1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达明显强于正常成人脑组织(P＜0.01),在CDl33+U251及CHG-5胶质瘤细胞中有很强的表达,在GFAP+和MAP2+U251及CHG+5胶质瘤细胞中的表达强弱不等,在MBP+U251及CHG-5胶质瘤细胞中早弱表达或不表达.在脑胶质瘤干细胞增殖过程中能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA及NO和TChH-1,HES-1蛋白表达;而在细胞分化时NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1,CBF-1,HES-1 mRNA和HES-1蛋白表达逐渐减弱.结论:NOTCH-1信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均有表达,而在正常成人脑组织中仅微弱表达.NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1和HES-1的表达强弱可能参与了胶质瘤干细胞增殖和分化的调控.     

Survivin基因沉默对恶性胶质瘤U87细胞的影响

目的探讨Survivin基因沉默对人脑胶质瘤细胞株U87体外细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞,通过western法检测干扰48h后Survivin蛋白的抑制率,通过MTT法观察转染后24 h、48 h和72 h细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染后48 h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞48 h后,Survivin蛋白的抑制率约为78%;阻滞U87细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论Survivin shRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U87细胞Sur-vivin基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。     

重组人IL-12真核表达载体稳定转染EMT6细胞株及表达鉴定

目的 构建人白细胞介素12(IL-12)稳定转染的细胞株EMT6/IL-12.方法 将人IL-12真核表达载体pcDNA6/v5-his-p70(pcDNA-p70)转染入小鼠乳腺癌细胞EMT6,筛选得到其稳定转染克隆EMT6/IL-12,并利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定其表达.结果 得到稳定转染IL-12的细胞株EMT6/IL-12,稳定传代3个月后仍有IL-12的表达.结果 人IL-12基因在小鼠乳腺癌细胞系中的稳定转染为进一步研究人IL-12抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础.     

新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体的构建

目的：构建4个新靶点的人CyclinE干扰RNA真核表达载体，转染人脑胶质细胞瘤U251细胞，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测mRNA表达，获得干扰效果最好的真核表达载体，为CyclinE成为人脑肿瘤标志物提供有价值的资料。方法（1）构建4个新靶点CyclinE干扰RNA的真核表达载体后，用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否；（2）用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤 U251细胞株；（3）通过 RT-PCR的结果检测转染后CyclinEmRNA表达量，选出干扰效果最好的1个。结果（1）成功构建了4个新靶点的CyclinE干扰RNA真核表达载体即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4。（2）CyclinEmRNA 表达明显受到抑制，并获得效果最好的CyclinE干扰RNA真核表达载体。结论成功构建并筛选出效果最好的新靶点Cy-clinE干扰RNA真核表达载体，使U251细胞的CyclinE mRNA表达明显降低。     

营养缺乏自噬因子1对人脑胶质瘤U251细胞增殖侵袭能力的影响

目的探讨营养缺乏自噬因子1对人脑胶质瘤U251细胞增殖侵袭能力的影响。方法复苏培养人脑胶质瘤U251细胞,建立转染小干扰RNA(siRNA)的NAF1组(si-NAF1组)、阴性对照组(si-NC组)、未转染siRNA对照组(control组),采用CCK-8实验检测细胞增殖能力、平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力、Transwell法观察各组细胞侵袭能力变化。结果与control组比较,NAF1-siRNA干预U251细胞后,si-NAF1组NAF1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05),其增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平降低,细胞增殖能力下降,克隆形成能力明显减弱,迁移能力明显降低,穿过Transwell膜的细胞数量明显减少(P均<0.05)。si-NC组与control组各项结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染siRNA后NAF1表达下降,进而下调PCNA水平,抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖能力;同时MMP-9蛋白表达水平下降,抑制U251细胞的迁移和侵袭能力。     

促Treg细胞生成及活化重组分子的构建与表达

本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原核表达载体pET-28a,生成pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,以Western blot方法鉴定表达结果。结果表明,成功扩增人TGF-β1及C2-C4区基因并分别克隆入pCR2.1-T载体,经亚克隆构建了重组蛋白的原核表达质粒pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,并转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得工程菌株,通过IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得表达。结论:本研究成功构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并获得原核表达。     

人脑胶质瘤CDK2干扰RNA新靶点的检验

目的 构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达,获得干扰效果最好的真核表达载体,为CDK2成为人脑肿瘤标志物提供有价值的资料.方法 (1)构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定;(2)用脂质体法瞬时转染上述4个载体到SHG44细胞株;(3)通过 RT-PCR 比较转染后CDK2 mRNA表达量,选出干扰效果最好的一个载体.结果 (1)成功构建了4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体即pGPU6/GFP/Neo-CDK2-1、pGPU6/GFP/Neo-CDK2-2、pGPU6/GFP/Neo-CDK2-3、pGPU6/GFP/Neo-CDK2-4;(2)CDK2 mRNA表达明显受抑制,并获得效果最好的CDK2干扰RNA真核表达载体.结论 成功构建并筛选出效果最好的新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,使SHG44细胞的CDK2 mRNA表达明显降低.