人胰液蛋白质组的双向电泳

目的 建立优化的用于胰液蛋白质组研究的双向电泳方法.方法 经内镜逆行胰胆管造影(ERCP)术收集纯胰液标本5例,分别进行多次双向电泳,比较不同标本保存时间、制备方法、泡胀液组成、固相pH胶条、等电聚焦条件及染色方案等因素对双向电泳图谱质量的影响.结果 胰液标本在-80℃保存4个月做双向电泳对图谱没有明显影响.根据图谱质量比较,三氯乙酸/丙酮沉淀继以含硫脲的泡胀液复溶是优化的标本制备方法;应用窄范围固相pH胶条可以在增加标本上样量的同时改善分辨率;银染和兼容质谱的银染方案所获得的图谱同样具有良好的重复性和分辨率;不同病理状态的胰液标本的双向电泳图谱表现出一定程度的相似性.结论 标本制备是胰液双向电泳的关键,优化的方法可以获得重复性好、分辨率高的双向电泳图谱,为不同病理状态下胰液蛋白质组学差异的研究奠定基础.     

人胰腺组织及胰腺癌细胞株蛋白质组的双向电泳分析

目的建立具有高分辨率和稳定性的胰腺癌蛋白质组研究的双向电泳方法。方法取正常胰腺、胰腺癌手术标本和胰腺癌细胞株，分别制备组织、细胞匀浆，提取蛋白质组分，进行双向电泳。结果加大蛋白酶抑制剂，应用两性电解质，可以得到理想的胰腺组织、细胞的蛋白质组分，并获得清晰、重复性良好的双向电泳图谱。结论胰腺组织细胞蛋白质双向电泳中，样本的制备和双向电泳的条件是关键因素。     

脊髓组织蛋白质组分析中双向电泳技术应用效果观察

目的观察脊髓组织蛋白质组分析中双向电泳技术的应用效果。方法以大鼠脊髓为研究对象,应用以固相pH梯度等电聚焦为第一向、均一水平十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向的双向电泳体系进行组织蛋白质组分析。结果获得了质量较好的脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱。结论脊髓组织蛋白质分析中双向电泳技术应用效果满意。     

钉螺肝脏蛋蛋白质双向电泳方法的建立

目的建立针对钉螺肝脏蛋白质组阵列分离的双向电泳方法。方法分析裂解液、细胞破碎、沉淀方法对钉螺肝脏蛋白质提取的影响,并优化双向电泳参数,建立钉螺肝脏蛋白质的提取方法和双向电泳条件。结果LysisⅢ（8mol/L尿素,4%CHAPS,65 mmol/L DTT,40 mmol/L Tris,0.5%IPG Buffer）提取钉螺肝脏总蛋白,2-D Clean-up试剂盒处理纯化总蛋白,等电聚焦参数为8000 v,50000 vh,成功获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,凝胶经EMBL银染,可分辨蛋白质斑点数约430个。结论建立了钉螺肝脏蛋白质双向电泳技术,为开展钉螺蛋白质组学研究奠定了良好基础。     

人胰腺组织及胰腺癌细胞株蛋白质组的双向电泳分析

目的建立具有高分辨率和稳定性的胰腺癌蛋白质组研究的双向电泳方法.方法取正常胰腺、胰腺癌手术标本和胰腺癌细胞株,分别制备组织、细胞匀浆,提取蛋白质组分,进行双向电泳.结果加大蛋白酶抑制剂,应用两性电解质,可以得到理想的胰腺组织、细胞的蛋白质组分,并获得清晰、重复性良好的双向电泳图谱.结论胰腺组织细胞蛋白质双向电泳中,样本的制备和双向电泳的条件是关键因素.     

肺癌与正常人血清蛋白质双向电泳差异分析

利用双向电泳(2-DE)分离肺癌患者和正常人的血清蛋白质,银染显色,Umax扫描仪获取图像,Melanie4软件分析图像,寻找肺癌相关差异蛋白质.结果建立了较稳定的肺癌和正常血清蛋白质2-DE图谱,平均蛋白质点数约400个.软件分析显示,两组共有11个差异蛋白质点,其中肺癌患者量上调的差异点9个,量下调的差异点2个.提示差异蛋白质分离为进一步肺癌相关血清蛋白质的鉴定和其他肿瘤血清蛋白质组学研究奠定了良好基础.     

慢性弓形虫感染大鼠脊髓组织蛋白质的双向电泳分析和质谱鉴定

目的观察慢性弓形虫感染大鼠脊髓蛋白质组的变化与差异表达,为探讨慢性弓形虫感染对脊髓损伤的分子机制奠定基础。方法将6只SD雄性大鼠随机分为对照组和感染组,每组3只。感染组每鼠腹腔感染纯化的RH株弓形虫速殖子107/ml×2ml,对照组每鼠腹腔注射灭菌生理盐水2ml。大鼠感染弓形虫10周后解剖,采用双向凝胶电泳分离脊髓总蛋白,经考马斯亮蓝染色后用Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),采用Mascot软件搜索MSDP、SWISS2PROT数据库鉴定蛋白质。结果慢性弓形虫感染大鼠和正常对照组大鼠脊髓蛋白斑点数分别检出(268±13)个和(301±15)个,对2张电泳图进行匹配后发现有7个蛋白斑点在2组大鼠脊髓组织中的含量发生了3倍以上的变化,有差异的7个蛋白斑点经质谱鉴定的数据检索发现3个差异表达蛋白质,分别为甘油三磷酸脱氢酶(similar to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein)和类肌动蛋白[cytoplasmic 2(Gamma-actin)]。结论慢性弓形虫感染对大鼠脊髓神经的损伤机制可能与能量代谢受阻和细胞增殖有关。蛋白差异点有可能成为慢性弓形虫感染的治疗靶点。     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.     

染氟成骨细胞的双向电泳和质谱鉴定

目的探讨双向电泳和质谱鉴定技术在染氟成骨细胞蛋白表达变化中的意义,为探索氟骨症发病机制提供有效手段。方法采用小鼠乳鼠颅骨来源的成骨细胞进行培养,抽提染氟(2mg/L)72h组和对照组成骨细胞蛋白,用双向凝胶电泳进行分离及ImageMaster2DElite软件分析电泳图谱,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对两组间比较具有统计学意义的差异蛋白点进行鉴定。结果在对照组成骨细胞蛋白双向电泳图谱上可观察到671个蛋白点,而在染氟组双向电泳图谱上可见到837个蛋白点;在染氟成骨细胞表达有明显差异的蛋白点经质谱鉴定出12种(7种蛋白表达增多,5种降低),主要是与细胞代谢旺盛、蛋白质氧化折叠和氧化应激等相关的蛋白。结论实验所采用的双向电泳和质谱鉴定方法可有效分离和鉴定成骨细胞蛋白点,为氟骨症的发生机制提供了有价值的新线索,表明蛋白质组学技术较其他方法具有很大的优越性。     

人胰腺癌胰液蛋白质谱差异表达初步分析

目的 应用蛋白质组学方法 分析胰腺癌胰液与慢性胰腺炎、胆总管结石患者胰液问差异蛋白质的表达,初步探索胰液中可能的胰腺癌标志物,为临床胰腺癌和慢性胰腺炎的鉴别诊断提供依据.方法 内镜下逆行胰胆管造影(ERCP)放置鼻胰引流管收集患者胰液,双向凝胶电泳(2-DE)分离5例胰腺癌、6例慢性胰腺炎和3例胆总管结石患者等量混合胰液的蛋白质,运用图像分析软件进行比较和分析,识别差异表达蛋白质.应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质点.结果 收集到胰液总量35～200 ml,Bradford法测定蛋白质浓度为0.8～4.6 μg/μl.胰腺癌、慢性胰腺炎和胆总管结石患者等量混合胰液凝胶的蛋白质点数分别为196±12、209±15和199±10,三组间两两对比后的平均匹配率均在75%以上.部分差异蛋白质点经MALDI-TOF-MS鉴定显示:相比胆总管结石和慢性胰腺炎,转甲状腺素蛋白(TTR)二聚体支链A在胰腺癌患者胰液中表达增高;载脂蛋白A1(ApoA-1)支链A、胰石蛋白支链、Reg1β再生蛋白前体表达降低.结论 人胰腺癌、慢性胰腺炎和胆总管结石患者胰液的蛋白质谱存在一定的差异,TTR、ApoA-1、胰石蛋白和Reglβ再生蛋白可能成为胰腺癌胰液中的肿瘤标志物,为临床胰腺癌和慢性胰腺炎的鉴别诊断提供依据.     

肝癌细胞亚细胞组分的双向凝胶电泳分析

目的建立超速离心方法分离亚细胞组分的技术路线，以提高肝癌细胞蛋白质组的双向凝胶电泳分离效率。方法体外培养的肝癌细胞QGY-7703匀浆破碎后，经差速离心分离成细胞核、20000xg沉淀、100000xg沉淀和细胞浆4个亚细胞组分，分别进行双向凝胶电泳，然后用ImageMaster软件分析电泳图谱。结果亚细胞组分分离后，电泳分辨率明显提高，特别是细胞核和细胞浆蛋白质的检出效率得到很大提高。不同亚细胞蛋白质组电泳图谱的差异显示了其蛋白质组构成的不同。结论超速离心是一种有效的亚细胞组分分离手段，蛋白质组技术与超速离心技术的结合能克服全细胞双向凝胶电泳的一些缺陷，并可将蛋白质组研究引向亚细胞水平。     

胰腺癌患者手术标本及胰液脱落细胞端粒酶活性的检测

目的 研究胰腺良，恶性患者手术标本，经ERCP所获胰液脱落细胞的端粒酶活性的表达，探索胰腺癌诊断的新方法。方法 采用TRAP-ELISA的方法检测胰腺癌细胞株，胰腺良恶性疾病组织物，胰液细胞的端粒酶活性。结果 6株胰腺癌细胞株均检测到了端粒酶活性，胰腺癌手术标本端粒酶的阳性率为63%（5/8），而4例正常胰腺组织和2例胰腺良性疾病患者的胰腺标本未检测到端粒酶活性，胰腺癌患者的胰液细胞中，有58%（11/19）检测到有端粒酶活性的表达，而胰腺良性疾病也有高达62.5%(5/8)的阳笥率，两者无差别。结论 胰腺癌组织标本中有较高的端粒酶活性表达；胰液脱落细胞检测端粒酶活性无助于鉴别胰腺良恶性疾病。     

胰腺癌患者胰液中K-ras基因突变的检测及其意义

目的 通过对经逆行胰胆管造影（ＥＲＣＰ）所获胰液的Ｋ－ｒａｓ基因突变检测,以探索胰腺癌诊断的新方法。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－限制性片段长度多态性的方法检测胰腺良、恶性疾病组织物、胰液上清和细胞的Ｋ－ｒａｓ突变。结果 胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有７１％（１５／２１）,而胰腺良性疾病无一例有Ｋ－ｒａｓ的突变。用胰液细胞有４％ＰＣＲ未能获得成功,胰腺癌胰液细胞Ｋ－ｒａｓ的突变率为６５％（１１     

结肠黏膜组织蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立与优化

目的为开展人类结肠黏膜组织的蛋白质组研究,建立并优化其蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术,提高其分辨率及重复性.方法采用电子结肠镜直视下活检钳取结肠黏膜组织,对组织蛋白质的提取方法进行改进以达到考马斯亮蓝法染色所需的浓度,优化双向凝胶电泳的关键因素与环节,如第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦的上样量及电泳参数,第二向垂直平板SDS凝胶浓度等.结果以固相pH梯度-IPG胶条(pH=3～10)进行第一向等电聚焦,以SDS均一胶(12.5%)的垂直电泳为第二向,成功地得到了人类结肠黏膜组织的双向凝胶电泳图谱.平均含333±36个蛋白点,匹配率85.56%.结论优化人类结肠黏膜组织蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术可以建立高分辨率和良好重复性的双向凝胶电泳图谱.     

Enzymic determination of acidic glycoconjugates in human pancreatic juice

Summary Acidic glycoconjugates (glycosaminoglycans, sulfated glycopeptide, and sialoglycopeptide) were isolated by precipitation with cetylpyridinium chloride from human pancreatic juice after digestion with pronase. The acidic glycoconjugates were found exclusively in the proteinaceous precipitate that occurred during dialysis against a buffer of low ionic strength. The concentration of the acidic glycoconjugates in normal pancreatic juice was about 2.4 mg/L. The acidic glycoconjugates were characterized by electrophoresis on cellulose acetate membrane and chemical analysis before and after digestion withStreptomyces hyaluronidase, chondroitinase AC, chondroitinase ABC, and heparitinase. It was found that the major acidic glycoconjugates were heparan sulfate (39.3%), sulfated glycopeptide (34.4%), chondroitin sulfate (14.2%), and the minor ones hyaluronic acid (6.4%) and sialoglycopeptide (5.7%).     

便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织蛋白质组双向凝胶电泳分析

目的:分析便秘型肠易激综合征(C-IBS)患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达的差异．方法:采用双向凝胶电泳(2-DE)技术和计算机辅助的图像分析方法,对C-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质进行分离和比较分析．结果:正常对照组平均胶蛋白斑点数为308,C-IBS组平均胶蛋白斑点数为238,与正常对照组平均胶匹配点数为178,匹配率74．79％．有18个蛋白质点的表达量存在明显差异,其中有3个蛋白点表达发生明显上调,有15个蛋白点表达发生明显下调．结论:C-IBS患者与正常人结肠黏膜组织蛋白质表达存在明显差异,可能与C-IBS的发病机制有关．     

胰液中人Hedgehog相互作用蛋白基因CpG岛甲基化状态及意义

结果 胰腺癌、CP及对照组患者胰液中HHIP基因CpG岛甲基化阳性率分别为54.8%(17/31)、2.8%(1/36)和6.7%(1/15),胰腺癌组的甲基化阳性率显著高于其他两组(P＜0.01).测序结果显示胰腺癌的HHIP基因有8个CpG位点发生甲基化,而CP及对照组的HHIP基因CpG位点未发生甲基化.结论 胰腺癌患者胰液中的HHIP基因CpG岛发生高甲基化,检测胰液中HHIP基因甲基化状态可能作为胰腺癌诊断的靶点.     

胰液分子生物学检测诊断胰腺癌研究进展

胰腺癌早期诊断十分困难,预后极差.近年胰液分子生物学检测对胰腺癌早期诊断带来了希望,包括胰液的癌基因、抑癌基因、微卫星不稳定性、蛋白质组学分析等.本文综述了上述研究进展.