miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

肾移植后早期检测尿转化生长因子β的临床意义

目的:探讨肾移植受者术后早期尿转化生长因子β1(TGF-β1)是否与远期移植肾功能有关联. 方法:1999-08/2001-04肾移植术后满1 a、肾功能正常的患者检测血、尿TGF-β1浓度,并对上述患者进行3 a以上的前瞻性观察,对观察期内肾功不全的患者明确是否为慢性移植肾肾病(CAN). 3 a后共有126例患者完成了全程随访,将其肾功能与3 a前的尿TGF-β1浓度作相关性分析,判断二者是否相关;比较术后1 a时尿TGF-β1不同浓度患者在3 a观察期内肌酐清除率(Ccr)损失量有无差异、CAN病例数有无差异;共有15例诊断为CAN的患者,比较CAN患者与非CAN (n-CAN)患者于肾移植1 a在血、尿TGF-β1等方面有无差异. 结果:术后1 a尿TGF-β1浓度为138.1～437.5 ng/g;尿TGF-β1浓度与3 a后的Ccr之间有相关性(r=0.429, P<0.01);尿TGF-β1浓度高的患者在3 a观察期内Ccr损失量明显大于尿TGF-β1浓度低的患者;n-CAN与CAN患者在肾移植1 a时,尿TGF-β1分别为(184.4±38.7)和(399.0±37.5) ng/g(P<0.01),血TGF-β1分别为(33.3±5.4)和(32.7±5.1) μg/L(P>0.05). 结论:TGF-β1可能在CAN的发生过程中起重要作用,CAN患者在肾功能异常前尿TGF-β1已显著升高,肾移植后早期检测尿TGF-β1对远期肾功能具有预测作用.     

青海地区丙型肝炎基因亚型与肝损伤、糖脂代谢

目的探讨青海地区丙型肝炎基因亚型与肝损伤、糖脂代谢相关性。方法收集149例抗-HCV、HCV-RNA均阳性的慢性丙肝患者血清,采用HCV-RNA荧光定量PCR法和反向免疫杂交法检测HCV-RNA载量和基因型,分析青海地区丙型肝炎基因亚型与肝损伤、糖脂代谢相关性。结果 149例检出1 b型61例、2 a型52例、3 b型18例、3 a型6例、6 a型0例、1 b/2 a型1例;性别以男性为主;年龄主要分布在30-60岁。1 b、2 a、3 b型丙肝患者CHOL存在统计学差异（P〈0.05）;1 b、3 b型丙肝患者GLU含量高,和2 a型患者比较存在统计学差异（P〈0.05）;其他指标无统计学差异。结论青海地区人群中HCV的基因亚型以1 b和2 a型为主,混有少量3 b和3 a型。1 b、2 a和3 b型糖、脂代谢存在差异性,HCV感染后易合并糖尿病和高脂血症。     

miR-23a调控ESRP1干预直肠癌细胞增殖和凋亡

目的 分析微小RNA-23a （microRNAs-23a,miR-23a）在直肠癌组织及细胞系中的相对表达水平,以及miR-23a对直肠癌细胞增殖和凋亡的作用,并分析其可能作用机制。方法 采用qRT-PCR检测miR-23a在36例直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平;利用qRT-PCR检测miR-23a在直肠癌SW480细胞及人正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达;合成miR-23a抑制剂（inhibitor） RNA片段和抑制剂阴性对照RNA片段（inhibitor negative control,inhibitor NC）,并将其分别转染至SW480细胞后,通过CCK-8法检测miR-23a inhibitor转染SW480细胞后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率;Western blot法检测上皮剪接调节蛋白1（epithelial splicing regulatory protein 1,ESRPl）蛋白在SW480细胞中的表达水平;构建野生型pGL3-ESRP1-3''UTR （wt-pGL3-ESRP1-3''UTR）或突变型pGL3-ESRP1-3''UTR （mut-pGL3-ESRP1-3''UTR）质粒,HEK293和SW480细胞经上述质粒分别与miR-23a inhibitor或inhibitor NC共转染后测定双荧光素酶活性。结果 与癌旁正常组织相比较,miR-23a在直肠癌组织中的相对表达水平明显上调,差异有统计学意义（P=0.000）;与NCM460细胞相比较,miR-23a在SW480细胞中的表达量显著上调,差异有统计学意义（P=0.000）;SW480细胞转染miR-23a inhibitor后,细胞增殖较inhibitor NC组下降35.54%±5.27%,两组结果差异有统计学意义（P=0.000）;转染miR-23a inhibitor后SW480细胞早期凋亡率明显高于inhibitor NC组（P=0.000）;荧光素酶报告基因结果表明ESRP1是miR-23a的直接靶基因;SW480细胞转染inhibitor NC后对ESRP1蛋白表达无明显影响,而转染miR-23a inhibitor至SW480细胞后ESRP1蛋白表达水平明显升高。结论 miR-23a在直肠癌组织和细胞系中的表达均显著升高,miR-23a可通过下游靶基因ESRP1从而调控直肠癌细胞增殖和凋亡。     

miR-128a在肝细胞癌中表达上调并通过靶向调控RND3 促进肝癌细胞增殖

目的检测MicroRNA-128a（miR-128a）在肝细胞癌中的表达情况并探讨其在肝癌细胞中的生物学功能及机制。方法收
集19例肝细胞癌及对应癌旁组织,运用qRT-PCR技术检测miR-128a 在肝细胞癌和对应癌旁组织及肝癌细胞株中的表达;应用
miR-128a mimics或inhibitor转染人肝癌细胞,MTT检测转染后细胞增殖活力变化;软件预测miR-128a的潜在靶点RND3,并用
双荧光素酶报告实验证实miR-128a与RND3 3’UTR结合,qRT-PCR和Western blot检测miR-128a潜在靶点RND3的表达变化;
Western blot检测细胞周期蛋白变化。结果在肝细胞癌组织中miR-128a的表达显著高于对应的癌旁组织（P<0.05）;miR-128a
促进肝癌细胞增殖（P<0.05）;在肝癌细胞中miR-128a通过与RND3 3’URT结合下调RND3 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）;抑
制miR-128a的表达可以导致cyclin B1、cyclin D1 和CDK4表达下调。结论miR-128a在肝细胞癌中表达上调并通过靶向调控
RND3促进肝癌细胞增殖。
     

中药治疗慢性非特异性溃疡性结肠炎62例

慢性非特异性溃疡性结肠炎 (Ulcereativecolitis,UC)是一种原因不明 ,与自身免疫有关的发生在结肠粘膜层的炎性病变。笔者从 1 997年1 1月至 2 0 0 1年 3月采用中草药内服加灌肠治疗该病 ,取得一定疗效 ,报道如下。1　临床资料治疗组 62例 ,其中男 2 2例 ,女 40例 ;年龄2 3～ 62岁 ,平均 3 9.2岁 ;病程最短 2 a 1个月 ,最长 2 6a,平均 1 1 .1 6a;病情轻度 1 2例 ,中度 46例 ,重度 4例。对照组 5 6例 ,其中男 1 8例 ,女 3 8例 ;年龄 1 9～ 63岁 ,平均 40 .1岁 ;病程最短 2 a 3个月 ,最长 2 4a,平均 1 0 .1 8a;病情轻度 1 1例 ,中度 42例 ,…     

主动脉夹层患者院内死亡的Bayes判别分析研究

背景　主动脉夹层（AD）是心血管系统的一种危急重症,具有发病急、病死率高的特点,既往缺少对AD患者院内结局预测的有效模型,随着近几年发病人数的不断增加,临床上迫切需要有效可靠的患者院内结局预测模型。目的　建立Bayes判别方程,预测AD患者院内死亡可能性,为临床制定有效的治疗方案提供参考。方法　采用统一标准收集2010年1月-2015年12月在余杭区第一人民医院（228例）、新疆医科大学第一附属医院（325例）就诊的553例AD患者的临床资料（一般情况、基础体征、检查指标）。根据患者院内是否存活分为存活组（n=470）和死亡组（n=83）,通过单因素分析筛选差异变量。再由计算机软件随机挑选患者作为样本集,通过Bayes判别分析建立Bayes判别方程。最后,利用剩余患者作为检验集,将其资料代入已建立的Bayes判别方程验证其准确性。结果　AD患者平均年龄（51.5±12.3）岁;男女比例为3.89∶1;院内病死率为15.0%（83/553）。最终纳入Bayes判别方程的变量为：发病时间（a1）、DeBakey分型（a2）、尿素氮（a3）、随机血糖（a4）、糖化血清蛋白（a5）、间接胆红素（a6）、国际标准化比率（INR）（a7）、纤维蛋白原（a8）,得到Bayes判别方程：Q1=1.174×a1+6.813×a2+0.323×a3+0.213×a4+10.522×a5+0.171×a6+25.656×a7+1.014×a8-39.843;Q2=-13.336×a1+27.131×a2-1.928×a3-5.030×a4+35.574×a5-0.658×a6+287.333×a7-3.509×a8-1 707.601。即将患者上述参数（a1~a8）分别带入Bayes判别方程中,当Q1>Q2时,认为该患者应归为存活组;当Q1相似文献   

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

Effect of anaphylatoxin C3a, C5a on the tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro

Background  Tubulointerstitial renal fibrosis is the common end point of progressive kidney diseases, and tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation (TEMT) plays a key role in the progress of tubulointerstitial renal fibrosis. Anaphylatoxin C3a and C5a are identified as novel profibrotic factors in renal disease and as potential new therapeutic targets. The aim of this study was to investigate whether C3a, C5a can regulate TEMT by transforming growth factor-β1 (TGF-β1)/connective tissue growth factor (CTGF) signaling pathway and the effects of C3a and C5a receptor antagonists (C3aRA and C5aRA) on C3a- and C5a-induced TEMT.

Methods  HK-2 cells were divided into C3a and C5a groups which were subdivided into four subgroups: control group, 10 ng/ml TGF-β1 group, 50 nmol/L C3a group, 50 nmol/L C3a plus 1 μmol/L C3aRA group; control group, 10 ng/ml TGF-β1 group, 50 nmol/L C5a group, 50 nmol/L C5a plus 2.5 μmol/L C5aRA group. TGF-β1 receptor antagonist (TGF-β1RA) 10 μg/ml was used to investigate the mechanism of C3a- and C5a-induced TEMT. Electron microscopy was used to observe the morphological changes. Immunocytochemistry staining, real-time PCR and Western blotting were used to detect the expressions of α smooth muscle actin (α-SMA), E-cadherin, Col-I, C3a receptor (C3aR), C5aR, CTGF and TGF-β1.

Results  HK-2 cells cultured with C3a and C5a for 72 hours exhibited strong staining of α-SMA, lost the positive staining of E-cadherin, and showed a slightly spindle-like shape and loss of microvilli on the cell surface. The expressions of α-SMA, E-cadherin, Col-I, C3aR, C5aR, TGF-β1 and CTGF in C3a- and C5a-treated groups were higher than normal control group (P <0.05). C3aRA and C5aRA inhibited the expressions of α-SMA, Col-I, C3aR, C5aR, and up-regulated the expression of E-cadherin (P <0.05). TGF-β1 and CTGF mRNA expressions induced by C3a and C5a were partly blocked by TGF-β1RA (P <0.05).

Conclusion  C3a and C5a can induce TEMT via the up-regulations of C3aR and C5aR mRNA and the activation of TGF-β1/CTGF signaling pathway in vitro.

     

腐胺对小鼠成纤维细胞中Atp8a1基因表达的影响

目的:研究腐胺对小鼠成纤维细胞中Atp8a1基因表达的影响,初步探讨其作用机制.方法:用基因芯片和Real-time PCR检测正常小鼠和Azin1(Antizyme inhibitor1)基因敲除小鼠肝脏组织中Atp8a1基因的在mRNA水平上的表达;构建Atp8a1基因启动子的虫荧光素酶报告质粒pGL3-Atp8a1-P;将重组质粒转染NTH3T3成纤维细胞中,分别在含有4 μg/ml腐胺和不含腐胺的条件下,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶活性.结果:在含有腐胺的培养条件下,转染Atp8a1基因启动子虫荧光素酶报告质粒的细胞虫荧光素酶的活性明显改变.结论:腐胺能够抑制Atp8a1基因启动子活性而降低其在NIH3T3成纤维细胞中的表达.     

microRNA-520a靶向MCM3抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖的研究

目的 阐述在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)细胞中microRNA(miR)-520a的表达和临床意义.方法 在非恶性血液肿瘤患者和B-ALL患者骨髓淋巴细胞及健康人外周血淋巴细胞、B-ALL患者细胞中利用实时定量PCR检测miR-520a的表达情况;在人急性B淋巴细胞白血病细胞株(BALL-1)中转染miR-520a模拟物,CCK-8观察细胞增殖能力变化,实时定量PCR检测miR-520a的表达变化.生物信息学分析MCM3是miR-520a的靶基因并预测位点;使用双萤光素酶报告基因检测miR-520a对MCM3的转录活性影响;在miR-520a mimics转染组中使用MCM3过表达质粒进行回补实验,观察MCM3蛋白和细胞增殖变化.结果 同正常组织/细胞相比,B-ALL患者细胞/BALL-1细胞系中miR-520a表达水平显著降低(P<0.05),miR-520a过表达能够使BALL-1细胞增殖能力降低(P<0.05);miR-520a过表达降低MCM3的蛋白表达水平(P<0.05);通过双萤光素酶实验验证miR-520a能够作用MCM3的3'UTR区;miR-520a mimics能够使BALL-1细胞增殖能力下降,同时过表达MCM3能够提高细胞增殖能力.结论 miR-520a可能通过下调MCM3的表达抑制B-ALL细胞增殖能力.     

miR-146a通过调节IRAK1影响急性胰腺炎炎症自噬机制的研究

目的 探究miR-146a在急性胰腺炎中的作用及机制。方法 用牛磺石胆酸3磷酸盐（TCLs）刺激AR42J细胞构建胰腺炎体外细胞模型,qPCR及ELISA法检测细胞miR-146a、白细胞介素1受体相关激酶1 (IRAK1)以及炎症因子白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)的表达变化,Western blot检测自噬相关分子LC3和p62的表达;分别过表达miR-146a和IRAK1,检测IL-6、TNF-α、LC3和p62等分子的表达变化;设计IRAK1 3’UTR与miR-146a结合位点突变质粒,通过荧光素酶报告基因实验探究miR-146a是否可以直接靶向IRAK1。结果 TLCs可以浓度依赖性地抑制miR-146a和诱导IRAK1表达,并可促进IL-6、TNF-α、LC3和抑制p62的表达。过表达miR-146a可在一定程度上阻断TLCs的作用;荧光素酶报告基因结果显示,miR-146a直接靶向并负性调控IRAK1分子。结论miR-146a通过靶向IRAK1抑制TLCs诱导的AR42J细胞炎症及自噬的发生。     

P3a波起源的研究

目的 探讨P300亚成分P3a波的解剖起源。方法 在兔AcgⅠ区[A4-5,L(R)0-1,H6-7],AcgⅡ区[A2-3,L(R)0-1,H6-7],acg7点额叶内侧面脑区(acg7') [A7,L(R)0-1,H6-7]放置颅内电极,分别损毁相应脑区后记录ERPs。采用听觉奇异模式诱发P3a波,在Pz点（相当于后囟处）记录P3a波。研究相关脑区损毁对P3a波的影响,推测出P3a波的起源部位。结果 AcgⅡ电解损毁后,P3a波与损毁前比较潜伏期无显著性差异(P>0.05),波幅降低有显著性差异(P<0.05);acg7点的额叶内侧面(acg7')损毁后,比损毁前的P3a 波潜伏期明显延长(P<0.01),波幅显著降低(P<0.01),但P3a 波仍未消失;扣带前回AcgⅠ区损毁后,P3a波消失, N2波潜伏期延长。结论 兔AcgⅠ区（Brodmann 25、32区）是兔P3a波的起源。     

稳定和不稳定性心绞痛患者血清hs-CRP、C3a的变化及其临床意义

目的:探讨高敏C反应蛋白(hs-CRP)和补体激活标志物C3a在不同类型心绞痛患者血清中的表达及其相关性。方法:测定了88例稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛患者血清总胆固醇、甘油三酯、hs-CRP、C1抑制因子、C3a和C5a含量;无创肱动脉超声测量肱动脉反应性(BAR)。结果:不稳定性心绞痛患者血清hs-CRP和C3a水平均高于稳定性心绞痛患者;不稳定性心绞痛患者hs-CRP与胆固醇(r=0.27,P<0.02)、C1抑制因子(r=0.32,P<0.001)、C3a(r=0.41,P<0.003)相关;二者肱动脉反应性无显著差异。结论:hs-CRP和C3a对不稳定性心绞痛有一定的诊断价值。     

中国西南三地HCV基因型的分布及临床特征

目的  了解丙型肝炎病毒（HCV）基因型在四川（川）、云南（滇）、贵州（黔）等中国西南地区汉族丙型肝炎患者中的分布及临床特征，为丙型肝炎的防治提供依据。方法  对221例来自川、滇、黔地区的丙型肝炎患者，采用焦磷酸测序法进行HCV基因分型并分析不同基因型丙型肝炎致病性的差异。结果  ①216例HCV- RNA阳性的丙肝患者被成功分型，共发现1、2、3、6等4种常见基因型和1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a等7种常见基因亚型，其所占比例为：1a型5.1%（11/216）、1b型36.1%（78/216）、2a型3.7%（8/216）、2b型0.9 %（2/216）、3a型7.4%（16/216）、3b型27.8%（60/216）、6a型17.1%（37/216），此外，还发现其他少见亚型（4a/6n）共4例，占1.9%（4/216）。②川、滇、黔分布前3位的基因亚型分别是3b、1b、6a和3b、1b、2a/3a及1b、6a、3b；男、女患者比例最高的亚型分别是3b（33.1%）和1b（48.3%）；>40岁患者以1b（39.8%）、3b（18.6%）、6a（15.9%）为主；<40岁患者以3b（37.9%）、1b（32.1%）、6a（18.4%）为主；感染方式以输血（血制品）40.1%为主，其他及不明原因者也占较大比例（33.8%）。③急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、丙肝后肝硬化和肝癌4种临床类型的丙型肝炎均以1b型比例最高，其次是3b、6a型；1b型患者的HCV载量及肝功能损害指标均高于其他亚型患者（P <0.05）。结论  川、滇、黔等中国西南部地区HCV-RNA阳性的汉族HCV感染者以1b、3b、6a为优势基因，且呈多样化分布；HCV载量较高的1b亚型，可能更容易导致患者肝功能的损害以及丙型肝炎的慢性化、肝脏的纤维化和癌变。

     

联合分析HCV种属信息区和高度保守区序列确定广东地区HCV基因型和亚型

目的扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5-UTR基因序列,用系统进化树法深入分析HCV基因型和亚型,阐明广东地区丙型肝炎患者HCV基因型和基因亚型的特点。方法采集99例慢性丙型肝炎病例血清,应用RT-PCR技术分别扩增HCVNS5B区和5-UTR特定片段,测序后进行系统进化树分析,确定HCV基因型及亚型。结果99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5-UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布:1a亚型1例、1b亚型59例、1型7例、2a亚型11例、3a亚型3例、3b亚型2例、3型3例、6a亚型13例;另有2例标本在两区段分型不同,5-UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不同,为HCV重组体。结论联合分析HCV不同区段基因序列,可提高HCV基因分型的准确度及灵敏性。广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为6a和2a;3型中的a、b亚型也占有一定比例。     

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。     

淫羊藿甙促成骨细胞分化的分子机制研究

【立论依据】 骨质疏松症是以骨量减少和骨的微观结构退化为特征,导致骨的脆性增加以致易于发生骨折的一种全身性代谢性骨病。骨质疏松严重威胁人类健康,且发病率呈逐年上升趋势,目前全世界约有2亿多骨质疏松症患者。目前临床上治疗骨质疏松的化学合成药物存在毒性大、价格昂贵等问题,而天然中草药及其制剂则可以克服上述缺点。淫羊藿(Herba Epimdii)是目前临床上治疗骨质疏松的常用中药,已有研究显示其主要成分淫羊藿甙(Icariine, ICA)具有促成骨分化功能,但具体机制不详。microRNA (miRNA)是一类长度约为20~25 nt、在基因转录后水平发挥调控作用的小分子非编码RNA,它几乎参与生物所有的生理病理过程。作为重要的生物调节分子,miRNA是否参与了ICA促成骨分化过程呢?关于ICA促成骨分化的分子机制的研究,可以为临床上提高淫羊藿治疗骨质疏松的效果提供理论和实验依据。 【设计思路】 首先确定ICA促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量,然后进行差异miRNAs筛选并选取部分差异miRNAs进行验证,最后挑选miR-27a进行深入研究。 【实验内容】 (1)ICA处理时间和剂量的确定:用MTT、real-time PCR确定ICA促MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量。(2)差异miRNAs的筛选:将5 μM ICA处理48 h 的MC3T3-E1 RNA及对照进行miRNA测序和分析。(3)差异miRNAs的验证:挑选15个差异miRNAs用Real-time PCR进行验证(已完成),并从中挑选miR-27a进行深入研究。(4)miR-27a在ICA促成骨分化中的作用及机制:① miR-27a靶基因的预测:运用miRWalk在线工具预测miR-27a的靶基因。② Osterix是miR-27a靶基因的验证:A. 构建含有Osterix 3'UTR以及miR-27a结合位点突变的荧光素酶报告质粒;B. 将miR-27a的mimic或对照和构建的荧光素酶报告质粒共转染HEK 293 T细胞,检测并比较荧光素酶活性;C. 将miR-27a的mimic或对照转染MC3T3-E1细胞,确定miR-27a对Osterix mRNA和蛋白表达的影响。③ miR-27a在ICA促成骨分化中的作用:将miR-27a的mimic、inhibitor和对照分别转染MC3T3-E1细胞,再用ICA处理,然后分别用Real-time PCR和碱性磷酸酶染色确定miR-27a在ICA促成骨细胞分化中的作用。 【材料】 HEK 293-T、MC3T3-E1细胞;pGL3-promoter荧光素酶报告基因载体、Real-time PCR用引物及试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体;碱性磷酸酶染色用试剂。 【可行性】 我们具备本课题实施所需要的研究材料包括试剂和仪器;课题设计所用的方法均为指导教师课题组常用的方法;本课题已顺利实施,我们目前已完成了ICA处理时间和剂量的确定、差异miRNAs的筛选和鉴定、miR-27a靶基因的预测。以上实验的实施和结果的获得表明本课题在理论和技术上均可行。 【创新性】 (1)首次证明miRNAs参与ICA促成骨细胞分化过程;(2)首次证明miR-27a 在ICA促成骨细胞分化中起重要作用。研究结果将进一步阐明ICA促成骨细胞分化的分子机制,从而为提高淫羊藿的临床治疗效果提供理论和实验依据。     

Foxo3a基因调控大鼠卵巢颗粒细胞体外发育及预防顺铂对卵巢的毒性作用

目的研究Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的调控及其预防顺铂卵巢毒性作用。方法大鼠原代颗粒细胞体外 培养,利用HE染色法及免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定;构建携带Foxo3a基因的重组腺病毒AD-rFoxo3a,利用RT-PCR及 Western-blot法检测Foxo3a表达;实验分为3组：实验组（AD-rFoxo3a组）、阴性对照组（rAD组）及空白对照组（Control组）,分别 绘制各组细胞生长曲线,Western-blot法检测各组cyclin D1、p27、Bax、Bim蛋白表达,利用流式细胞术、Hoechst33342/PI法分别 检测细胞周期及细胞凋亡情况,流式细胞术检测各组细胞加入最适浓度顺铂后细胞凋亡情况。结果（1）体外分离培养大鼠原 代卵巢颗粒细胞存活率>90%,细胞纯度>95%;（2）重组腺病毒AD-rFoxo3a感染颗粒细胞36 h后Foxo3a基因在mRNA水平高 表达,感染48 h后在蛋白水平高表达;（3）实验组细胞增殖受到抑制,G1期细胞比例及细胞凋亡率较空白对照组及实验对照组增 加（P<0.01）,后两组差异无统计学意义;（3）实验组Bim、p27、cyclin D1蛋白较对照组高表达,而各组Bax蛋白表达无明显差异; （4）加入顺铂24 h后实验组细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组（P<0.01）,后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。结论 过表达Foxo3a基因在体外可能通过促进cyclin D1和p27蛋白表达诱导大鼠卵巢颗粒细胞静止在G1期,通过增加Bim蛋白表达 诱导颗粒细胞凋亡;同时过表达Foxo3a基因在体外不能逆转顺铂导致的颗粒细胞凋亡,其对于卵泡发育的调控及预防顺铂对 卵巢的毒性作用还有待体内实验进一步研究。     

1—及3—硝基苯并[a]芘混合物在大鼠肝微粒体中代谢产物的探讨

本文分析了1—硝基苯并[a]芘和3—硝基苯并[a]芘混合物在体外有氧条件下的代谢产物及代谢速率,并同单一的1—硝基苯并[a]芘和3—硝基苯并[a]芘的代谢产物进行比较。结果表明,1—及3—硝基苯并[a]芘混合物的代谢产物与单一的1—或3—硝基苯并[a]芘的代谢产物是相同的;而且两者按摩尔比等量混合后的代谢速率也是一致的。实验还表明,需要把高压液相色谱仪的反相柱和正相柱结合起来使用,才能把1—和3—硝基苯并[a]芘混合物的代谢产物完全分开。