树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

树Ju载脂蛋白AIcDNA的克隆及其组织表达

克隆不易感动脉粥样硬化动物树Ｊｕ（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白Ａ－Ｉ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点,方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序,序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８     

BM P-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法 根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用One step RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果 琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示一长约451bp的条带。阳性克隆质粒经双酶切可切出约451bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论 利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

载脂蛋白A1基因克隆及序列分析

目的 :克隆人载脂蛋白A1 (apoA1 )基因。　方法 :选择人胎肝组织 ,提取总RNA ,以此为模板 ,利用RT PCR法获取apoA1成熟肽基因片段 ,琼脂糖电泳分离纯化所得目的基因并克隆至T Vector ;ABI 377自动序列分析仪分析所得基因序列。　结果 :PCR产物经琼脂糖电泳 ,目的基因片段与预期大小相符 ;序列分析仪分析所得基因序列 739bps,与国外报道的完全相同。　 结论 :从人胎肝组织成功克隆apoA1基因     

幽门螺杆菌外膜蛋白cagL基因的克隆、表达及其对IL-8 mRNA表达的影响

目的:克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)NCTC11637菌株cagL基因,并探讨其对IL-8 mRNA表达的影响.方法:设计cagL引物,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后测序分析, 用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体cagL-PET28a(+)转化E.coli BL-21(DE3),IPTG诱导表达, 镍亲和层析纯化,SDS- PAGE及蛋白质印迹鉴定表达蛋白.纯化蛋白与细胞GES-1共培养,提取细胞总RNA,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达.结果:测序分析表明cagL编码成熟肽的碱基序列为654 bp,编码217个氨基酸,与基因库公布的其他H.pylori菌株的基因序列同源性为96%～98%,氨基酸同源性为 97%～99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域;表达蛋白的相对分子质量约为32 000,蛋白质印迹检测融合蛋白具有良好的抗原活性;重组蛋白作用于GES-1细胞后,可诱导细胞因子 IL-8 在 mRNA 水平上的表达.结论:CagL蛋白可刺激GES-1细胞IL-8 mRNA的表达.     

北京鸭肝组织cDNA文库的构建及ApoAIcDNA克隆的筛选和测序（简报）

北京鸭ApoAI基因结构及与人和易患AS动物Ap0AI基因结构之异同目前尚不清楚，本研究利用富含鸭ApoAImRNA的肝组织，构建鸭肝组织cDNA文库，并从该文库中筛选、测出鸭ApoAIcDNA克隆序列。取健康成年雄性北京鸭2g肝组织，液氮冷冻后，按一步法快速提取鸭肝细胞总RNA，再经olig。（dt）一纤维素柱层析，分离出肝细胞mRNA。以4pgmRNA为模板，采用Pharmacia的TimeSaverSynthesisKit合成。DNA的一镇、二链。经对合成产物进行酚抽提并过SepharoseCL-4B凝胶层析柱后，将双链cDNA朱端与4pl含ECORI／N0tl酶切点的连接子连接。甲…     

家兔胆固醇酯转移蛋白基因克隆及其真核表达载体的构建

目的: 克隆家兔胆固醇酯转移蛋白(CETP) 基因,构建其真核表达载体,研究CETP基因的结构与功能,为进一步研究CETP在动脉粥样硬化(As)中的作用机制提供参考。方法: 采用TRIzol提取家兔肝组织总RNA,采用RT-PCR 方法将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用LA Taq酶进行PCR扩增,克隆出CETP基因,将CETP cDNA片段克隆至pMD19-T载体上,对重组的CETP- pMD19-T测序后,登录GenBank进行序列比对,利用nnPredict软件分析预测CETP的二级结构。将CETP
cDNA片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。结果：测序及序列比对显示与M27486基因序列98%相符;家兔CETP基因cDNA全长1 659 bp,编码序列(CDs区)长1 494 bp,编码498个氨基酸。CETP的二级结构以α螺旋结构为主,相对分子质量为142119.4, pI为4.91。结论: 成功克隆了家兔CETP基因,并成功构建了其真核表达载体,明确了CETP的二级结构。     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。     

一个含有25bp内含子的阴道毛滴虫Rabl-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rabl-like基因（TvRabl-like）及其内含子。方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析。结果 序列分析结果表明该eDNA克隆长705bp,开放阅读框具603bp,推测肽链含有200个氨基酸。序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rabl亚家族的亚型。进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rabl亚家族。基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5’GT-AG-3’和分支位点基序。RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在。结论 TvRabl-like基因属于阴道毛滴虫Rabl亚家族,该基因含有一个25bp的内含子。该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子。对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化。     

IFITM1克隆测序及生物信息学分析

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因(interferon induced transmembrane protein 1.IFITM1)克隆、测序,对序列进行分析,并获取生物学信息.方法 以IFITM1的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,在EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,将IFITM1的cDNA片段克隆到pUCm-T质粒,对重组的pUCm-T-IFITM1测序后,采用All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences Database 和 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)对IFITM1的cDNA进行生物信息学分析. 结果扩增后,含有IFITM1基因cDNA的PCR产物约1000 bp,IFITM1的 cDNA成功克隆到pUCm-T质粒并进行测序.序列分析结果显示,IFITM1结构cDNA全长683bp, 有2个外显子.IFITM1的 mRNA编码的氨基酸在37～57和87～107有2个跨膜区,编码125个氨基酸的多肽,其蛋白相对分子质量为14kDa.结论 IFITM1基因的成功扩增、克隆、测序,获取了IFITM1基因的cDNA、mRNA以及编码蛋白质氨基酸的生物学信息,有利于研究IFITM1基因与大肠癌的关系.     

THE TREE SHREW APOLIPOPROTEIN C-I cDNA：SEQUENCE AND ITS EXPRESSION

A rabbit anti-serum to tree shrew apolipoprotein C-I (apo C-I) was used to screen an expression cDNA li-brary constructed by us from tree shrew (TS) liver tissue. Two apo C-I cDNA clones were obtained. The longerone consists of 380 nuclcotides, including 21 bp and 95 bp at the 5‘‘ and 3‘‘ and of the non-translated regions respectively, and a 264-bp fragment in an open reading frame encoding 88 amino acids prepropeptide which conrains 26 amino acids of signal peptide and a mature protein (62 amino acids). Comparing the amino-acid sequence deduced from this cDNA with those of the published mammalian apo C-Is reveals that it shared some struc-tural similarity with rat, mouse and dog ape C-I, but it had 5 more amino acids than that of human and baboon.The expression of ape C-I mRNA in 8 different tissues were also assayed with Northern blot. The results demonstrated that liver had the highest expression, intestine had much less expression and no expression in other tissues,which is much different from human and other species. This study has laid down a good foundation for further studying on the function and the stucture of tree shrew apo C-I gene.     

转基因小鼠人载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响

目的研究载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ）基因表达调控对血浆高密度脂蛋白（ＨＤＬ）代谢的影响。方法采用已建立的含小鼠金属硫蛋白Ｉ（ＭＴ－Ｉ）启动子的人ａｐｏＡＩ转基因Ｃ５７ＢＬ／６小鼠系,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测锌诱导前后人ａｐｏＡＩ基因整合和表达的情况。结果转基因小鼠整合４～１５拷贝的人ａｐｏＡＩ基因。人ａｐｏＡＩ基因主要在肝和肾中表达,经重金属锌诱导后,人ａｐｏＡＩ基因可在肝、小肠及肾中高效表达。转基因鼠血浆总ａｐｏＡＩ水平比对照组明显增高,其中人ａｐｏＡＩ水平经锌诱导后增高约４６％。与对照组相比,血浆ＨＤＬ水平在锌诱导前后分别增高约４７％和１０３％。转基因鼠ＨＤＬ和人ａｐｏＡＩ水平间呈显著正相关（ｒ＝０．８５,Ｐ＜０．０１）。结论ＡｐｏＡＩ对血浆ＨＤＬ水平升高有重要的调节作用,该转基因鼠是进一步研究ａｐｏＡＩ在高脂血症时对脂质代谢的影响和抗动脉粥样硬化（ＡＳ）作用机制的理想动物模型     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

Biological function of a novel gene overexpressed in human hepatocellular carcinoma

Objective To clone the full-length of a differentially expressed cDNA fragment, LC27, and study its biological function tentatively. Methods Northern blot was used to analyze the expression pattern of LC27 in hepatocellular carcinoma, matched nontumor liver tissues, fetal liver and normal adult liver tissues, as well as BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line ESTs splicing and 5’ rapid amplification of cDNA ends (5’ RACE) were used to clone the full-length of LC27 cDNA.An antisense oligodeoxynucleotide approach was used to investigate the biological role of the gene in the proliferation of BEL-7402 cells. Results A 2186 bp novel cDNA with an open reading frame encoding a 283 amino acid protein was cloned.Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that it is 38% (88/229) identical to human Golgi 4-transmembrane spanning transporter MTP.The gene and the encoded protein was termed hepatocellular carcinoma overexpressed transmembrane protein (hotp) and HOTP, respectively.Hotp mRNA was almost undetectable in normal adult liver and fetal liver tissues.However, it was significantly up-regulated in hepatocellular carcinoma and some matched nontumor liver tissues, as well as BEL-7402 cells.The proliferation of BEL-7402 cells was suppressed by an antisense oligodeoxynucleotide against hotp mRNA at a concentration of 50 μg/ml. Conclusion HOTP may be an integral membrane transporter protein.The overexpression of the gene in hepatocellular carcinoma may play an important role in hepatocarcinogenesis and disease progression.     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

一个含有25 bp内含子的阴道毛滴虫Rab1-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rab1-like基因(TvRab1-like)及其内含子.方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析.结果 序列分析结果表明该cDNA克隆长705 bp,开放阅读框具603 bp,推测肽链含有200个氨基酸.序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rab1亚家族的亚型.进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rab1亚家族.基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25 bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5'GT-AG-3'和分支位点基序.RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在.结论 TvRab1-like基因属于阴道毛滴虫Rab1亚家族,该基因含有一个25 bp的内含子.该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子.对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化.     

人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列分析

目的：阐明人源性肝细胞生长因子(HDSSF)的本质，为进一步基因克隆奠定基础。方法：以简并PCR扩增获取目的基因片断；杂交筛选人胎肝cDNA文库；末段终止法进行HDSSF核苷酸序列分析。结果：简并PCR扩增出接近HDSSF分子量600bp片断；人胎肝cDNA文库经初筛和复筛获得含有目的基因的单克隆噬斑；测定了HDSSF基因序列，其cDNA链为748bp，含有594bp的完整开放读码框架和5′及3′末端非编码区序列。序列分析显示HDSSF应为一含有198个氨基酸残基的新的促肝细胞生长物质。结论：本研究成功获得目的基因HDSSF克降．人HDSSF克隆成功为开展人源性HDSSF的重组产品研制奠定了基础。