植物血凝素及淋巴因子激活的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的MTT比色法分析

目的　检测植物血凝素及淋巴因子激活的杀伤细胞（ＰＨＡ－ＬＡＫ）的体外广谱抗肿瘤作用。方法 用ＭＴＴ比色法测定 ＰＨＡ－ＬＡＫ对体外培养的Ｋ５６２、ＭＧｃ８０－３、１４３ＴＫ－、ＨｅＬａ、ＬｏＶｏ等５种肿瘤细胞的杀伤活性。结果ＰＨＡ－ＬＡＫ对５种不 同组织器官来源的肿瘤细胞均有明显杀伤活性,在效靶比为７．５：１．０时,ＰＨＡ－ＬＡＫ对１４３ＴＫ－细胞的杀伤率可高达 ５７．３％,杀伤效应随效靶比增加而升高;但在效靶比为１５：１时,杀伤效应不随效靶比增加而增高数。结论　（１）来自健康献血 员的ＰＨＡ－ＬＡＫ对肿瘤细胞具非特异性杀伤活性,能较好解决传统过继免疫治疗中免疫效应细胞的数量和活性问题; （２）在一定的条件下,ＭＴＴ法用于检测免疫效应细胞的杀瘤作用时才具灵敏、可靠的优点。     

树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法,并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用。方法 分离外周血单个核细胞,应用GM－CSF及IL－4诱导DC产生,用TNF－α和PGE2促进其成熟,并用肺癌细胞系GLC－82可溶性抗原致敏。将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC－LAK）,用MTT法检测DC－LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 经GM－CSF,IL－4,TNF－α,PGE2作用后,细胞表达CD1a阳性率为71．0％,CD8350．0％,CD14阳性率低于10．0％,高表HLA－I,HLA-Ⅱ和CD45,为典型的DC表型特征。DC－LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC－82,A549,moser和MCF－7）的杀伤率,前为84．7％,66．9％,49．3％和56．0％,后为43．5％,31．3％,45．0％和32．4％。结论 成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC。     

原发性卵巢癌患者CD_3AK细胞和LAK细胞杀瘤活性比较

为探讨CD3AK细胞和LAK细胞杀瘤作用的特异性及靶细胞选择性，对比观察了3例原发性卵巢癌患者CD3AK细胞和LAK细胞对卵巢癌细胞系（3AO）和人早幼粒细胞白血病细胞系（HL60）的杀伤活性。结果表明：LAK细胞在培养第1～3周，各效靶比（10：1，20：1，40：1）对HL60的杀伤活性略高于对3AO的杀伤活性，但差异无显著性（P＞0．05）；CD3AK细胞在培养第1周，各效靶比（10：1，20：1，40：1）对HL60的杀伤活性均显著高于对3AO的杀伤活性（P＜0．05），而培养第2、3、4周时，对HL60和3AO的杀伤活性无显著区别（P＞0．05）。提示：LAK细胞和CD3AK细胞均缺乏杀瘤特异性，而CD3AK细胞具有一定的靶细胞选择性。     

PHA、抗CD_3单克隆抗体、LI-2诱导牌细胞培养上清液抗肿瘤效应的研究

本文探讨了PHA、CD_3单克隆抗体、IL-2体外诱导正常人脾细胞培养上清液抗肿瘤效应及其对LAK细胞抗肿瘤效应的增强作用。结果显示，IL-2诱导脾细胞的培养上清液在体外不仅具有直接杀伤肿瘤细胞效应，并且能增强LAK细胞的抗肿瘤作用。PHA、抗CD_3单克隆抗体和IL-2联合刺激可增强脾细胞培养上清液杀伤肿瘤细胞效应。     

CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导和体外杀伤活性的比较

目的：探讨CD3AK细胞与LAK细胞的诱导、增殖动力学和杀伤活性的变化。方法：采用抗CD3单克隆抗体（anti-CD3McAb)和rIL-2及PHA（植物血凝素）共刺激法诱生扩增CD3AK细胞,用等量rIL-2 t PHA共刺激法诱生LAK细胞。观察它们的增殖动力学变化;用MTT法以K562细胞和H7402细胞为靶细胞,测量CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性。结果：微量的anti-CD3McAb辅以少量的rIL-2和PHA就能诱导和大量扩增CD3AK细胞,其扩增能力显著高于LAK细胞（P<0.001);CD3AK细胞对K562细胞和H7402细胞的杀伤活性显著高于LAK细胞（P<0.05)。结论：CD3AK细胞的扩增能力及杀伤活性均较LAK细胞为强,是更为有效的杀瘤效应细胞。     

LAK细胞对直肠腺癌细胞杀伤的观察

采用体外培养方法,在恒温(37℃)和5％CO_2条件下,连续观察LAK细胞对直肠腺癌细胞系(HR8348)的结合率。杀伤活性及杀伤动态。结果表明:HR8348细胞对LAK细胞杀伤较敏感,在相同的效靶比例条件下,4h时效靶细胞结合率为52.0±3.6,LAK细胞杀伤率为49.0±2.3％。效靶细胞结合率及杀伤率呈正相关(P<0.01),LAK细胞的杀伤取决于效靶细胞的稳定结合。LAK细胞杀伤HR8348的动态过程是:效靶细胞主动趋向运动→相互识别→接触与结合→LAK细胞发挥杀伤作用→靶细胞溶解。LAK细胞杀伤作用随效靶共育时间延长乃效靶比例的增高而增强。     

MTT法检测AU14-1介导LAK细胞的细胞毒效应

目的 应用MTT比色法研究抗小鼠宫颈癌单克隆抗体(McAb)AU14-1介导淋巴因子激活的杀伤细胞Gym-phokine activated killercells，LAK)对靶肿瘤细胞的体外细胞毒作用。方法 通过检测不同数量小鼠宫颈癌U14细胞与加入四甲基偶氮唑盐{[3-(4，5-dimethylthiazof-2-y1)-2，5-diphenyl terazolium bromide]，MTT}后形成甲质颗粒所产生的不同吸光度(A)值，建立测定的线性关系。进而应用MTT比色法研究McAb AU14-1介导LAK细胞的体外细胞毒作用。结果 当U14细胞在10～10^5个／孔以内时，活细胞数与A值呈直线相关；LAK细胞对于经AU14-1处理的肿瘤细胞的杀伤率显著高于未经AU14-1处理的肿瘤细胞(P＜0．01)。结论 McAb AU14-1可加强LAK细胞对靶细胞的溶解作用。提示特异性宫颈癌单克隆抗体AU14-1介导的细胞毒在治疗宫颈癌中可能是一种有潜在价值的方法。     

四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用的比较

目的：比较四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用。方法：选用脐带血制备LAK细胞，并与临床常用的外周血、胎脾及胸腺LAK细胞在体外扩增及抗肿瘤作用方面比较。结果：脐带血的扩增能力显著高于其余3种LAK细胞（P＜0．01），每份脐带血LAK细胞总数可增殖至2．5×1010；抗肿瘤活性以脐带血LAK对SMMC-7221肝癌细胞出现最早（第3d）、活性最强（85％±3％），明显强于其余三者（P＜o．01）；对K562的杀伤作用仍属脐带血LAK最强；而胸腺LAK的活性最弱。结论：脐带血LAK细胞体外增殖快，杀伤活性强，可用于肿瘤的过继性免疫治疗。     

LAK细胞之诱导条件的探讨

目的探讨LAK细胞的诱导条件.方法采用不同含量的r-IL-2T和PHA制备LAK细胞,经台盼兰拒染实验计数法及MTT比色法检验LAK细胞数目及活性.结果在r-IL-2 300μ/ml和PHA10μg/ml时,制备的LAK细胞数量多,杀伤活性较高.结论结论r-IL-2和PHA可诱导LAK细胞增殖.     

MTT法检测CIK细胞的体外杀瘤活性

目的：观察CIK（cytokine induced killer)细胞的体外杀瘤活性。方法：以LAK（lympho kine activated killer) 细胞作对比，用MTT法测定并比较CIK细胞与LAK细胞的体外杀瘤活性。结果：CIK细胞的体外杀瘤活性明显优于LAK细胞，杀伤率分别为29％和15％，结论：CIK细胞是一种具有较强杀伤活性的免疫效应细胞，有可能用于抗肿瘤的生物治疗。     

穿孔素对不同肿瘤细胞的杀伤作用

目的：研究穿孔素对不同肿瘤细胞株的杀伤作用是否一致,以确定肿瘤细胞对穿孔素的杀伤是否有抵抗作用。方法：大量培养LAK细胞,制备含穿孔素毒性颗粒的LAK细胞裂解物,用红细胞裂解试验证实LAK细胞裂解物的杀伤活性,培养穿孔素敏感的K562肿瘤细胞株和穿孔素不敏感的Hela,MGC80-3肿瘤细胞株,用流式细胞计数的方法研究LAK细胞裂解物对3种不同肿瘤细胞的杀伤作用。结果：红细胞裂解试验证实,LAK细胞裂解物具有杀伤活性;抗人穿孔素（Human perforin HP)McAbs可封闭LAK细胞裂解物对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用,LAK细胞裂解物对K562细胞的杀伤是通过穿孔素依赖途径的。结论：穿孔素对K562,Hela和MGC80－3肿瘤细胞的杀伤明显不同,说明肿瘤细胞存在对穿孔素的抵抗机制。     

抗原致敏DC联合LAK细胞对肺腺癌细胞杀伤作用的研究

目的：观察抗原致敏树突状细胞（DC）联合淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞对肺腺癌细胞的杀伤作用。方法：采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMC）,常规诱导出DC、LAK细胞。倒置显微镜观察细胞的形态和增殖情况;应用流式细胞仪（FCM）测定细胞表型上变化鉴定这两种细胞。流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化;利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测法把DC-LAK细胞和DC-LAK-A549细胞作为效应细胞,肺腺癌A549细胞作为靶细胞,进行杀伤试验。结果：①体外诱导单个核细胞培养出DC和LAK细胞。②共培养后DC-LAK细胞的免疫表型表达增加。抗原致敏DC联合LAK细胞（DC-A549-LAK）组的免疫表型表达与对照组相比更有显著性意义。③共培养细胞在增殖倍率上有显著意义。④MTT显示共培养后的LAK细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。结论：从外周血单个核细胞中诱导出具有典型形态和免疫表型的DC和LAK细胞。DC和LAK细胞共培养细胞,增殖活性、免疫表型、杀伤活性方面高于单纯培养的LAK细胞。抗原致敏后DC-A549-LAK抗肿瘤效应增强更显著。     

CD3AK的制备及杀菌作用观察

目的：观察CD3AK（抗CD3单克隆抗体）的活化及对肿瘤细胞的杀伤活性。方法：以不同的肿瘤细胞为靶细胞,以人外周血淋巴细胞为效应细胞,在体外用不同浓度的抗CD3单克隆抗体和／或IL－2进行激活,用MTT法观察细胞毒杀伤作用。结果：CD3AK的扩增率较LAK高一个数量级,且对不同的肿瘤细胞均有杀伤作用。其18h杀伤均大于4h。结论：由于CD3AK较LAK对IL－2的需要量少,扩增率高,而比LAK更有临床应用发展前景。     

济南假单胞菌菌苗促LAK活性的研究

研究了济南假单胞菌菌苗（PJV）在体外对小鼠脾LAK细胞活性的影响。结果表明，1．PJV对YAC－1肿瘤靶细胞在3．9－62．5μg/ml浓度范围内对单个核脾细胞有明显的刺激增殖作用，此增殖细胞对肿瘤靶无杀伤作用；2．PJV在LAK细胞的诱导阶段可增加其诱导数量和增殖活性，提高伤活性，但PJV在LAK细胞杀伤阶段对其活性无影响，3．PJV不能单独促进脾产生细胞IL－2，但可促进ConA诱导脾细胞产生的IL－2活性。     

妇科肿瘤患者CD_3AK细胞对卵巢癌细胞杀伤活性动态观察

为探讨妇科良、恶性肿瘤患者CD3AK细胞体外对肿瘤细胞的杀伤活性，将5例妇科良性肿瘤，12例妇科恶性肿瘤患者的外周血单个核细胞制备成CD3AK细胞，用MTT法测定CD3AK细胞对卵巢癌细胞系（3AO）的杀伤活性，同时观察不同效靶比的杀瘤情况，每周测定1次，共4周。结果：①良性肿瘤组CD3AK细胞对3AO的杀伤活性随着效靶比的增大而增强，在培养第1、4周，效靶比为20：1和40：1的杀瘤活性明显高于10：1；动态观察其杀瘤活性，培养第2周最低，第3、4周则较强；②恶性肿瘤组CD3AK细胞杀瘤活性当效靶比为10：1时低于20：1和40：1；动态观察其杀瘤活性，培养第2、3周高于第1、4周；③良、恶性肿瘤相比，CD3AK细胞杀瘤活性于培养第2周恶性肿瘤组显著高于良性肿瘤组（10：1，20：1）（P＜0．05），培养第4周（20：1）良性肿瘤组又显著高于恶性肿瘤组（P＜0．05）。结果提示：良、恶性妇科肿瘤患者CD3AK细胞对肿瘤的杀伤活性并不相同，临床上应针对良、恶性肿瘤患者CD3AK细胞的各自特点，选择适宜的治疗时间。     

LAK细胞及活化胚胎胸腺细胞对脑胶质瘤细胞的体外作用

目的：探讨体外培养后人胚胎胸腺细胞（ETC）表面抗原的转变及进行移植的时机,比较不同源LAK细胞、活化ETC联合与TJ905细胞的体外作用效果。方法：对不同处理的人胚胎胸腺悬液培养前后观察,测定细胞表面抗原,进行LAK细胞,活化ETC体外杀瘤活性比较。结果：应用特殊培养液培养,可以使人胚胎胸腺上皮细胞生存28天,分离后悬液比混悬液细胞表达抗原早期达稳定（CD4／CD8＝2．26）,胸腺LAK细胞对TJ905细胞的杀伤作用与脾LAK细胞无显著性差异。结论：活化ETC在体外对肿瘤细胞无抑制作用,不同源LAK细胞和活化ETC联合对TJ905人脑胶质瘤细胞有杀伤作用。     

丁酸钠抑制淋巴因子激活杀伤细胞杀瘤活性的研究

目的：探讨低浓度丁酸钠(sodium butyrate)对人结肠腺癌细胞SW1116表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和癌胚抗原(CEA)表达的影响及其对淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞杀伤活性的改变。方法：噻唑蓝(MTT)比色法检测经不同浓度丁酸钠处理4天后SW1116在不同效／靶比下对LAK细胞杀伤敏感性的改变，流式细胞术和免疫荧光法定量和定性检测丁酸钠对ICAM-1和CEA表达的影响。结果：MTT显示，经0．5、1和2mmol／L丁酸钠处理后，细胞对LAK细胞杀伤敏感性从74．6％下降至15．9％(效／靶为20)，且在一定程度上有浓度依赖性，当效／靶为10时亦呈类似变化，与之对应的ICAM-1阳性细胞数从92．2％下降至7．6％，而CEA阳性细胞数从1．2％上升至16．6％，荧光显微镜下与流式细胞术的改变相一致。结论：丁酸钠减弱LAK细胞对人结肠癌细胞SW1116的杀伤，这种作用可能与其降低ICAM-1同时增加CEA的表达，从而改变效／靶细胞的结合有关。     

MtbAK细胞与CD3AK、LAK细胞全外增殖和杀瘤活性比较

目的：比较结核杆菌抗原激活的杀伤细胞（MtbAK）、CD3AK及LAK细胞的体外增殖能力和杀瘤活性。方法：分别和结核杆菌抗原（Mtb-Ag）、CD3 mAb和rIL-2刺激人外周血单个核细胞（PBMC）,在含rIL-2的RPMI1640培养液中诱导扩增MtbAK、CD3AK和LAK细胞,用计数法动态观察细胞扩增情况,在流式细胞仪上分析MtbAK中的γδT细胞比例,以MTT法检测三种扩增细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性。结果：与CD3AK和LAK细胞相比,MtbAK细胞具有更强的增殖能力和较高的细胞毒活性。结论：MtbAK细胞在体外更易于扩增,具有较高的杀瘤活性,有可能应用于肿瘤患者的临床过继免疫治疗。     

不同疗程CIK治疗患者的CIK细胞的细胞毒活性研究

目的探讨不同疗程CIK治疗肿瘤患者CIK细胞体外抗肿瘤作用的差异.方法分离多疗程和单疗程CIK治疗肿瘤患者的外周血单个核细胞（PBMC）,加入细胞因子诱导CIK细胞,用MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀伤活性,用流式细胞仪检测其免疫表型.结果不同疗程患者的CIK细胞对肿瘤细胞都有一定细胞毒活性,当患者行多疗程治疗时,效靶比在4：1、8：1和16：1时,对BGC-823和SPC-A-1的细胞毒性较单疗程强,但以SPC-A-1低效靶比4：1时差异更为明显.另外,多疗程组的CD3＋CD56＋细胞含量显著高于单疗程组（P〈0.05）.结论多疗程CIK治疗患者的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果强于单疗程CIK治疗患者,多次CIK治疗延长肿瘤患者生存期,提高生活质量,对肿瘤复发有较好的作用.     

妇科恶性肿瘤患者CD_3AK细胞与LAK细胞体外增殖能力动态观察

采用CD3MAb＋IL－2联合刺激法制备了妇科恶性肿瘤患者CD3AK细胞，体外动态观察CD3AK细胞的形态特征及增殖能力，井与LAK细胞进行比较。结果显示：①CD3AK细胞与LAK细胞在体外分别经CD3MAb（0．5mg／L）＋IL－2（105U／L）和IL－2（106U／L）刺激后，细胞体积增大，继之变为不规则形；②CD3AK细胞培养第1周增殖倍数为2．89，至第4周增殖倍数达109．37倍，均显著高于同期培养的LAK细胞的增殖倍数；③CD3AK细胞体外存活时间为4～5周，而LAK细胞仅为2～3周。结果提示：CD3AK细胞制备简便，体外存活时间长，增殖能力强，可以为临床提供充足的过继免疫效应细胞。