含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

白细胞介素-2对乙型肝炎病毒基因疫苗免疫效应的影响

目的　构建表达乙型肝炎病毒 (HBV)S蛋白的重组质粒pCR3 .1 -S作为基因疫苗 ,观察重组人白细胞介素 - 2 (rhIL - 2 )作为佐剂对其诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响。方法　以不同剂量IL - 2作为佐剂 ,生理盐水作为对照 ,测定不同免疫组的血清抗HBs、淋巴细胞增殖活性、淋巴细胞杀伤活性 ,比较不同免疫组间体液和细胞免疫应答的差异。结果　抗HBsELISA滴度 ,IL - 2组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5) ;淋巴细胞增殖指数、淋巴细胞杀伤率 ,IL - 2　 1 0 0 0U/ (只·次 )组、IL - 2　 2 0 0 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5) ,而IL - 2　 50 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　一定剂量的IL - 2作为佐剂可增强HBV基因疫苗的免疫效应。     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的　探讨丙型肝炎病毒 (HCV)包膜基因 E1E2 ,对核心基因 C DNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用 .方法　构建包含HCV C或 CE1E2基因片段的真核表达载体 p HCV- C和 p HCV- CE1E2 ,分别接种于 BAL B/c小鼠股四头肌 (以空载体 pc DNA3作为对照 ) ,每间隔 2 wk加强免疫 1次 .用 EL ISA法检测免疫小鼠血清中抗 HCV C特异性抗体的产生 .以 p HCV- C转染并表达 HCc Ag的 Sp2 /0细胞为靶细胞 ,采用 5 1 Cr释放试验检测特异性 CTL的杀伤作用 .结果　两个实验组免疫的 2 0只小鼠均产生抗 HCV C特异性抗体 ,当效 /靶细胞比例为 10 0∶ 1时 ,CTL 的杀伤率均明显高于对照组 (P<0 .0 1) ;而 p HCV- CE1E2与 p HCV-C组之间 ,无论是抗 HCV C抗体的滴度还是 CTL的杀伤率均无显著性差异 (P>0 .0 5 ) .结论　 E1E2基因的加入 ,并没有增加HCV C基因 DNA疫苗诱导的抗 HCc Ag特异性抗体的滴度和 CTL 的杀伤作用 .     

HBV adr亚型基因疫苗诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV)adr亚型基因疫苗pCMV-S2.S(PS），观察其诱导小鼠所产生的特异性体液和细胞免疫应答。方法：将PS注射于C57BL／6小鼠胫骨前肌内，应用ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体以及采用^51Cr释放实验检测淋巴细胞杀伤功能。结果：注射基因疫苗1周后，血清中抗HBs抗体转阳，4周后抗体达到高峰，并以高水平维持至少8周；第12周时PS诱导小鼠产生了良好的HBV特异的细胞免疫应答（P＜0.05）。结论；所构建的HBV adr亚型基因疫苗PS能够诱导小鼠产生较好的体液和细胞免疫应答。     

乙型肝炎病毒核心区DNA疫苗接种后H-2d小鼠的特异性免疫应答

目的　观察乙型肝炎病毒 (HBV)核心区DNA疫苗接种后BALB/c(H 2 d)小鼠的特异性免疫应答。方法　构建HBV核心区DNA疫苗 (PJW430 3/HBc) ;用基因枪法和肌内注射法将该DNA疫苗接种BALB/c小鼠 ;ELISA法检测小鼠血清抗 HBc(IgG)及IgG亚类 (IgG1,IgG2a) ;51铬释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性。结果　该DNA疫苗在体外转染细胞中可良好表达HBcAg。血清抗 HBc终点滴度在DNA疫苗基因枪组和肌肉注射接种组小鼠分别为 1∶32 80 5 0和 1∶10 935 0。两组小鼠的抗 HBcIgG亚型均以IgG2a略占优势。两组小鼠的HBbAg特异性CTL杀伤活性分别达到 5 1 1%和 5 5 2 %。结论　HBV核心区DNA疫苗在小鼠实验中具有良好的细胞免疫和体液免疫原性。     

HBV S基因重组体的构建及免疫小鼠的实验

目的 :探讨 HBV核酸免疫的可行性。方法 :采用 PCR技术 ,扩增得到编码 HBV HBs Ag的 S基因片段 ,将其插入到真核表达载体 pc DNA3,酶切鉴定并测序确证 ,得到质粒 pc DNA3- S,转染至 COS- 7细胞表达。将所构建的核酸疫苗免疫小鼠 ,观察其诱导产生的特异性体液免疫和细胞免疫功能。结果 :HBV S基因序列与文献报道一致 ,转染真核细胞后能表达目的蛋白。免疫小鼠后实验组和阳性对照组抗 - HBs阳性率分别为 70 % (7/ 10 )和 80 %(8/ 10 ) ,抗体水平分别为 (32 .14± 13.79) m IU/ ml和 (2 8.5 0± 11.87) m IU/ ml,两者比较无显著性差异 (P>0 .0 5 )。对照组和空白组抗 - HBs均为阴性 ,小于 10 m IU/ ml。实验组和阳性对照组的特异性 CTL杀伤率在效∶靶比为 2 0∶ 1时分别为 (35 .4 0± 4 .85 ) %和 (38.2 0± 7.6 9) % ,效∶靶比为 10∶ 1时则分别为 (2 3.95± 3.98) %和 (2 4 .5 5±3.5 9) % ,两者比较无显著性差异 (P>0 .0 5 )。对照组和空白组的 CTL杀伤率在效∶靶比为 2 0∶ 1和 10∶ 1时均小于 5 %。结论 :pc DNA3- S直接经肌肉免疫小鼠可诱导产生特异性体液和细胞免疫反应     

基因疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤免疫研究

目的　观察 HBV DNA疫苗 (p CR3.1- S)诱导 BAL B/ c小鼠 (H- 2 d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P815 - HBV- S) (H- 2 d)成瘤性的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,背部皮下接种 P815 - HBV- S细胞 ,观察成瘤情况 ,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性 .结果　接种 DNA疫苗后小鼠成瘤率为 12 .5 % ,对照组为 10 0 % .小鼠平均存活期大于 38.2 d,对照组为 2 8.4d,40 d后小鼠存活率为 87.5 % ,对照组为 0 % . CTL细胞杀伤活性明显增加 ,p CR3.1- S组5 1% ,对照组为 2 1% (P<0 .…     

丙型肝炎病毒E2基因激发小鼠细胞免疫的实验研究

目的 :研究丙型肝炎病毒E2基因接种能否诱导机体产生细胞免疫以及乙型肝炎病毒preS基因对其诱导细胞免疫能力的影响。方法 :以BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞株 (SP2 /O)为宿主细胞 ,建立表达丙肝病毒E2蛋白的靶细胞 ,将其注射于E2基因或 preS与E2融合蛋白基因免疫的小鼠腹腔 ,记录小鼠接种瘤细胞后的存活期 ,以小鼠存活期的长短作为反映基因免疫小鼠对HCVE2蛋白细胞免疫的有无或强弱的指标。结果 :靶细胞表达了相对分子质量约为 70 0 0 0的E2蛋白 ,E2基因接种小鼠的存活期长于对照组 ,单独E2基因接种组的存活期显著长于对照组 ,也长于 preS与E2融合蛋白基因免疫组。 结论 :E2基因接种能诱导细胞免疫 ,但与 preS融合后 ,其诱导细胞免疫的能力会降低。     

乙型肝炎病毒基因疫苗免疫小鼠的初步研究

为构建编码HBV表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S,将它直接肌肉注射BAIB/c小鼠,以ELISA法检测免疫小鼠血清,另用~3H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖活性。结果表明,HBV基因疫苗pCR3.1-S可诱发小鼠产生体液和细胞免疫应答。     

CpG-ODN增强乙型肝炎病毒转基小鼠对重组乙肝疫苗的细胞免疫应答

[目的 ]探讨CpG -ODN作为佐剂对重组乙肝疫苗诱导乙肝病毒转基因小鼠产生细胞免疫应答的影响。[方法 ]用重组干扰素 (rIFNα - 2b)、重组乙肝疫苗 (rHBsvaccine)和重组乙肝疫苗 CpG -ODN分别免疫HBV转基因小鼠后 ,流式细胞仪检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群 ,ELISA法检测免疫小鼠的外周血IL - 2、IL - 12 (p70 )和IFN -γ的含量 ,MTT法和乳酸脱氢酶法分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能。[结果 ]重组乙肝疫苗组CD3 、CD4 、CD8 细胞在T细胞中所占百分比分别为 (2 5 .0 0 8± 2 .85 2 ) %、(13.6 40± 1.6 16 ) %、(9.989± 1.12 3) %均明显高于对照组 ,(P <0 .0 5 ) ;IL - 2、IL - 12 (p70 )和IFN -γ的含量分别为 (130 4 .2 88± 5 72 .2 12 ) pg/mL、(2 0 3.810± 91.80 7) pg/mL、(86 0 .736± 336 .888)pg/mL均明显高于对照组 ,(P <0 .0 5 ) ;淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应与对照组相比均有明显差异 ,(P <0 .0 5 )。疫苗 CpG -ODN组与疫苗组比较 ,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答 (P <0 .0 5 ) ,且以Th1型细胞免疫应答为主。而干扰素组由于给药次数和剂量等原因 ,与对照组无显著差异。 [结论 ]CpG -ODN作为佐剂可以较好的增强重组乙肝疫苗诱导HBV转基因小鼠产生细胞免疫应答。     

HBV S基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答

目的 观察小鼠对IL-12基因表达质粒与HBVS基因疫苗联合免疫的免疫应答。方法 用已构建的HBVS基因疫苗（pCR3.1-S)和表达IL-12p35和p40蛋白的真核表达载体pWRG3169分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法检测小鼠血清抗-HBs及脾细胞对HBsAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2wk后小鼠血甭抗-HBs滴度及脾细胞对HBsAg的刺激指数均明显高于对照组,pWRG3169 pCR3.1-S组明显高于单纯pCR3.1-S注射组。结论 IL-12表达质粒可以增强pCR3.1-S基因疫苗诱导的体液和细胞免疫应答强度,尤以细胞免疫增高明显。     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

乙肝核酸疫苗对荷瘤小鼠免疫保护作用的实验研究

目的 观察乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答, 及对表达HBV preS2S抗原的SP2/0-S2S肿瘤细胞攻击的保护作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为3组, 于0、4及8周分别接种pCMV-S2S(实验组)、乙肝表面抗原蛋白疫苗(HBsAg,对照组1)、空载质粒( pCMV,对照组2 )各3次.末次免疫后4周,每组各取3只小鼠,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性.各组其它小鼠均用于肿瘤细胞攻击实验:分别于一侧胁部皮下种植SP2/0-S2S细胞,同时于另一侧种植不表达HBV preS2S抗原的SP2/0-CMV 细胞作阴性对照.种植肿瘤细胞(荷瘤)后观察成瘤时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间及生存率.结果 pCMV-S2S组CTL活性为(34.21±1.38)%,高于HBsAg组[(19.64±1.50)%]和pCMV组[(3.45±1.89)%](P＜0.05).荷瘤后10 d,pCMV-S2S组小鼠SP2/0-S2S细胞的成瘤率为58.3%,低于SP2/0-CMV细胞的成瘤率(91.7%)(P＜0.05);两对照组SP2/0-S2S细胞与SP2/0-CMV细胞的的成瘤率无明显差异.荷瘤后pCMV-S2S组初次出现死亡小鼠的时间为24 d,较两对照组均延迟了13 d,平均生存时间为(31±1) d,较两对照组延长(P＜0.05);4周生存率(75%)高于两对照组(P＜0.05), 两对照组之间生存时间及生存率差异无统计学意义.结论 HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,对荷瘤小鼠具有特异性免疫保护作用,可望用于HBV感染的免疫保护.     

IL—12提高DNA疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤的免疫研究

目的 观察ＩＬ－２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果 对照组、ｐＣＲ３．１－Ｓ及共同免疫     

结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫

目的: 构建以结核分枝杆菌H37Rv cfp10基因为基础的基因疫苗. 方法: 采用BamH I和Xba I双酶切质粒pGEM-Teasy-CFP10中,10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳回收约300 bp大小片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1的相应酶切位点. 阳性克隆提取质粒,体外电穿孔转化CHO细胞,RT-PCR法检测cfp10特异的mRNA的表达. 质粒肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体的滴度. 结果: 用BamH I和XbaⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体pcDNA3.1,命名为pcCFP10; pcCFP10转化的CHO细胞RNA提取物中,RT-PCR扩增出300 bp大小的条带. 肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体平均滴度为1∶ 4,000. 结论: 以CFP10的编码基因为基础的真核表达质粒的构建成功.