用UDPE技术检测和鉴定鼠疫耶尔森氏菌

我们建立了用ＵＤＧ（尿嘧啶糖基化酶）防ＰＣＲ产物污染,以两个不同基因为靶序列扩增检测同一病原菌和用微孔板杂交－酶联显色检测ＰＣＲ产物的ＵＤＰＥ（ＵＤＥ－ＤｕｐｌｅｘＰＣＲ－ＥＩＡ）技术并用于鼠疫耶尔森氏菌的检测与鉴定。结果表明,该系统可以特异地检测和鉴定鼠疫耶尔森菌,检测灵敏度可以达到１ＣＦＵ／ｍｌ。     

鼠疫耶尔森氏菌快速检测研究进展

目的论述一套对鼠疫耶尔森氏菌特异性强、快速、灵敏度高的快速检测方法,对鼠疫做到早发现、早预防、早诊断、早治疗,预防和控制鼠疫的发生和流行。方法查阅和收集国内外相关鼠疫耶尔森氏菌快速检测的文献和资料。结果鼠疫耶尔森氏菌检测技术向着快速、敏感、特异的标准化和国际化方向发展,其检测技术更加先进、齐全、完备。结论鼠疫耶尔森氏菌的检测技术从细菌学、血清学及分子生物学等正向更快速、更先进的方向发展,这对鼠疫防治将发挥重要作用。     

用PCR-EIA法快速检测鼠疫耶尔森氏菌

目前在全国鼠疫监测工作中,对鼠疫菌的检测都采用显微镜观察、培养、鼠疫噬菌体裂解实验和动物试验（称为四步检验）。这些传统的检测方法在鼠疫防治监测工作中发挥了重要的作用,但是,一旦遇到标本量大时,这些方法就显得烦琐、费时,而且也增加了检验者的工作量。近几年发展起来的ＰＣＲ－ＥＩＡ（Ｐｏｌｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ－Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）技术,敏感度高,特异性强,同时也保证了ＰＣＲ扩增技术的可靠性,可直接从动物脏器中检测出鼠疫苗ＤＮＡ,尤其是对大量标本的检测其优点更为突出…     

斑点金-薄层色谱法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的建立一种简便、快速的斑点金-薄层色谱法(DIGFA-TLC)用于鼠疫耶尔森氏菌的快速定量诊断。方法用柠檬酸钠还原法制备10 nm的胶体金标记鼠疫耶尔森氏菌多价抗体,制备成鼠疫抗体金探针,通过薄层色谱扫描对样品斑点进行定量测定。结果斑点金-薄层色谱法对鼠疫FI抗原的最低检出限为5 ng;对EV76的最低检出限为1.2×105cfu;且二者呈高度的正相关关系,前者相关直线方程为y=448.467 37+2.511 43x,后者相关直线方程为y=375.760 88+4.112 31×10-4x;整个反应过程在10 min内完成。结论该方法简便、快速、特异、敏感,可以实现鼠疫耶尔森氏菌的定量监测。     

鼠疫耶尔森氏菌质粒提取方法的改进

大多数鼠疫耶尔林菌均含有三种质粒，分子量分别为６５，４５和６Ｍｄａｌ。其中两种属大质粒，分离提取较困难。本实验在参照Ｃａｓｓｅ法基础上对质粒提取中诸多影响因素逐一进行测试比较，选择出质粒提以的最适条件：细菌培养于２８℃，１８－２２小时，菌液浓度为２００ｍｇ／ｍｌ，溶菌液ＳＤＳ终浓度２％，每１０ｍｌ溶菌液加０．１ＮＮａＯＨ１．３５ｍｌ，４５℃温育３０－４０分钟。建立了一种简便，快速且重复性较高的提取     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

准噶尔盆地鼠疫耶尔森氏菌营养需求的实验分析

目的探讨新疆准噶尔盆地鼠疫野外分离株的营养需求。方法应用定性和定量两种方法相结合分析准噶尔盆地28株鼠疫菌对11种氨基酸的营养需求。结果准噶尔盆地28株鼠疫菌株中,低营养型1株(No.25,Phe+)占检测菌株的3.57%;色氨酸依赖1株(No.24,Try-)占检测菌株的3.57%;苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸依赖,异亮氨酸半依赖1株(No.21,Phe-、Met-、Val-、Ile±)占检测菌株的3.57%;余下25株表现为对苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸依赖(Phe-、Met-、Val-)占检测菌株的89.3%。结论新疆准噶尔盆地鼠疫菌株的营养型主要表现为对苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸依赖(Phe-、Met-、Val-)。     

青海田鼠型鼠疫耶尔森氏菌生物学性状的研究

目的：通过试验菌株与对照菌株相比较，观察其生物学性状，确定试验菌株的生态型。方法：选择生物化学试验、毒力决定因子、营养型、毒力、质粒及外膜蛋白等项目。结果：试验菌株与对照菌株生物学性状有较大差异，生化性状为鼠李糖＋、甘油＋、脱氨－、麦芽糖＋、阿胶糖－、密二糖＋，毒力因子是鼠疫菌荚膜抗原（FraI^ )、毒力抗原（Vwa^ )、鼠疫菌素I（PstI^ )、色素沉着因子（Pgm^ ),营养型为精氨酸、亮氨酸依赖型（Arg^-、Leu^-),质粒为6、45、65Mdal质粒等。结论：确定了我国一个新的鼠疫菌生态型－青藏高原青海田鼠型鼠疫菌。     

鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

耶尔森氏菌属中致病性细菌有3种，即鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。其中鼠疫耶尔森氏菌是致病性最强的一种。随着分子生物学的研究进展，人们对鼠疫菌有了深入的了解。鼠疫菌外膜蛋白（Yops）是近些年对鼠疫菌的基础研究内容焦点之一。国内在世界上首先发现鼠疫菌锡林郭勒高原型病原体缺少32Kd外膜蛋白和40Kd蛋白位于膜内，     

鼠疫耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳分析

目的 对鼠疫菌的全DNA进行酶切，了解我国各别生态型的鼠疫耶尔森氏菌在核酸水平上的差异。方法 用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分析。结果 用PFGE可将20株鼠疫菌分成5个核型，I型为布氏田鼠型和青海田鼠型菌；Ⅱ型为滇闽居民区型菌和滇西丛谷型菌；Ⅲ型为祁连山型、青藏高原型和1株分离自四川患的鼠疫菌。西藏仲巴地区的2株菌各为一个型。结论 提示脉冲场凝胶电泳分析可用于鼠疫耶尔森氏菌遗传关系的研究。     

多重PCR检测方法在鼠疫监测中的应用

目的验证在鼠疫疫源地调查中应用多重PCR方法快速检测鼠疫菌的实用性。方法在14个省的17个鼠疫监测点采集标本2524份。选用针对鼠疫菌特异序列的引物,并加入内部对照模板,直接从鼠肝、脾等脏器标本中进行鼠疫核酸检测,与细菌分离培养结果相比较并进行统计学分析。结果两种检测方法的符合率为92.67%。PCR方法阳性检出率为10.38%,较细菌培养阳性检出率(4.48%)高(x~2=682.25,P<0.01)。结论多重PCR方法可应用于鼠疫监测中,比传统方法迅速、灵敏,但还有待于优化。     

从动物和土壤中直接检测鼠疫耶尔森氏菌

目的　探讨用防污染的 PCR- EL ISA(U DPE)技术检测人为污染的土壤和感染的动物标本的可行性。方法　根据鼠疫耶尔森氏菌 Cafl和 Pla基因分别设计了 3条引物 ,组合成 3对引物 ,建立 U DPE检测技术。结果　利用该实验体系可以检出每克土壤中 10 0 0个鼠疫耶尔森氏菌的污染。比检测纯细菌的敏感性低 2 0 0倍 ,说明土壤中有抑制 PCR反应的因子。对 2 0只实验组动物 40份标本 (肝脏和脾脏 )的培养、U DPE和 PCR-电泳检测表明 ,3种方法的检出吻合率为 10 0 % ,均能从 40份标本中检出靶细菌 ,而用 3种方法检测对照组动物的 2 0份肝脏和脾脏均为阴性。结论　利用 UDPE技术可以被用于动物脏器中鼠疫耶尔森氏菌的检测     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

鼠疫菌fra基因探针的研究

利用ＰＣＲ的方法，由鼠疫菌的ＤＮＡ中扩增获得了单一的，长２４９ｂｐ的基因片段。这一反应的特异性良好，可以作为鼠疫菌的一种鉴定标志。将这一片段地高辛标记制成探针，与国外已经试用过的，来自９．５ｋｂ质粒的９００ｂｐ探针相比较，表明该探针的特异性优良，可用于鼠疫的监测与对鼠疫菌分子生物学的进一步研究。     

贵州省鼠疫耶尔森菌生物学特征研究

目的研究贵州省鼠疫耶尔森菌的生物学特征,探讨疫源地性质。方法对37株鼠疫菌进行生化试验、营养需求试验、毒力基因检测、随机扩增多态性DNA分析和脉冲场电泳分析。结果37株鼠疫菌均不发酵鼠李糖和甘油,发酵麦芽糖和阿拉伯糖,脱氮阳性。选择20株代表菌株检测均为苯丙氨酸依赖(Phe )、谷氨酸半依赖(Glu±);用Pla、Cafl、inv、hms4对引物分别进行PCR扩增,均得到456、249、1000和700bp的目标基因条带;随机引物(RAPD)分析均获得505、790、1140和1680bp的条带;脉冲场电泳图谱显示338、242.5、168和77kbp的条带。结论贵州省鼠疫菌株的生物学特征与云南省滇闽居民生态型鼠疫菌相同。     

胶体金免疫层析法诊断鼠疫的特异性试验

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫快速诊断的特异性。方法采用胶体金免疫层析测试条和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)平行检测。结果检测鼠疫菌F1抗原具有很强的特异性,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森等其他细菌发生交叉免疫反应。结论该方法简便、快速、敏感,适合现场鼠疫监测。     

鼠疫耶尔森菌特异基因扩增引物应用于鼠疫菌的鉴定研究

目的研究一种快速鉴定鼠疫菌的PCR方法。方法选用针对鼠疫菌特异序列的6对引物进行PCR扩增,以其它近缘的肠道致病菌做对照,并测序比较鉴定。结果鼠疫菌均能扩出预期产物,而其他近缘的肠道致病菌菌株均不能扩出预期产物。结论这些引物具有较高的特异性,可迅速、有效地鉴定鼠疫菌,并与其它近缘的肠道致病菌相鉴别。     

双重PCR和RAPD技术在宁夏鼠疫菌鉴定中的应用研究

目的应用多重PCR和RAPD结合鼠疫常规检测方法对可疑鼠疫菌和自毙鼠脏器进行鉴定,应用多种实验室检测方法联合检测和鉴定鼠疫菌,为科学、快速、有效地判定鼠疫疫情提供实验室支持。方法采用双重PCR对2009年宁夏2个鼠间鼠疫监测点分离获得的可疑菌株和部分自毙鼠脏器进行目标基因fra和pla片段扩增,并利用RAPD技术对2个监测点分离获得的鼠疫菌进行随机引物扩增基因表征分析。结果共分离获得16株菌,所有菌株扩增出2条目标条带,分别为249 bp和456 bp。自毙鼠脾脏扩增出目标基因,肝脏扩增的目标基因条带较弱。RAPD显示所有菌株的扩增条带一致,表明此次分离得到的鼠疫菌株未发生变异。结论双重PCR可作为实验室快速诊断和迅速判定鼠疫疫情的有效方法,用RAPD法筛选的鼠疫菌扩增的随机引物可为确定宁夏分离鼠疫菌株的标识图谱提供参考。