人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达

目的构建含人AChRα1亚单位胞外段(Hα1-210)-IgG1Fc融合基因的真核表达载体,表达人AChR-Fc融合蛋白。方法扩增Hα1-210基因,插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中,构建重组表达载体pAN-Hα1-210,并经酶切、测序鉴定;采用脂质体法将重组载体转染CHO-K1细胞,经G418加压筛选、ELISA检测,挑选高表达融合蛋白的阳性转化子扩大培养;表达的AChR-Fc融合蛋白经Protein A亲和层析柱纯化,SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果酶切及测序结果证实Hα1-210基因序列正确,真核表达载体pAN-Hα1-210构建成功;ELISA检测证实AChR-Fc融合蛋白在细胞培养上清中呈分泌表达;SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的相对分子质量约为51 000;Western blot结果显示该融合蛋白能被特异性单克隆抗体mAb198所识别。结论成功构建pAN-Hα1-210真核表达载体,并获得具有生物活性的AChR-Fc融合蛋白,为进一步开展融合蛋白靶向B细胞治疗重症肌无力的研究奠定了基础。     

人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒的快速构建及其鉴定

目的 构建人的AWP1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因的重组腺病毒载体，为研究AWP1的生物功能提供工具。方法将克隆的AWP1 cDNA插入高效表达RFP的载体pDsRedl-N1的多克隆位点，与RFP序列形成AWP1-RFP融合基因，将该融合基因亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV和pAdShuttle-CMV中：经酶切鉴定正确后Pine I线形化，与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183以同源重组：用lipofectAMINE将Pac I线形化的同源重组腺病毒载体转染293细胞以包装腺病毒：通过同源重组病毒载体和病毒颗粒基因组的DNA测序及PCR扩增和在293细胞中的表达鉴定重组腺病毒。结果同源重组载体和病毒颗粒的DNA测序和PCR分析显示AWPIcDNA序列正确，感染293细胞获得了AWP1-RFP融合蛋白的高效表达。结论成功构建和包装了人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的 构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达.方法 RT-PCR方法扩增SEPT7 cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达.用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析.结果 成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调.细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低.结论 成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展.     

大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景: Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题。 目的：构建Akt1基因真核表达载体 pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达。 设计、时间及地点：观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成。 材料：pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5α、293细胞为自备。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1DNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,构建Akt1真核表达载体 Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞。 主要观察指标：蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达。 结果：经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达。 结论：构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达。     

杆状病毒蛋白表达系统制备可溶性LRIG1蛋白及其鉴定

目的为进一步研究肿瘤的治疗提供高质量的可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白(sLRIG1)。方法用重组sLRIG1的杆状病毒(Bac-sLRIG1)感染sf9昆虫细胞,表达的蛋白经提纯,获得sLRIG1蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹进行分析鉴定。结果使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)成功表达了重组sLRIG1蛋白,最佳感染复率为5,孵育时间为72 h,经鉴定蛋白表达正确,纯度高达95%。结论用BEVS可成功获得大量高纯度重组sLRIG1蛋白,可满足后续实验的需要。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

胶质瘤PTEN和细胞周期蛋白D1表达及其意义

目的　探讨胶质瘤组织中PTEN和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达的意义。 方法　应用免疫组化结合计算机图像分析方法检测PTEN和CyclinD1蛋白在 80例胶质瘤的表达及其相关关系。结果　PTEN阳性率为 6 3.8% (5 1/ 80 ) ,低分级胶质瘤 (I～II)阳性率显著高于III级和IV级 (P<0 .0 1) ;胶质瘤不同病理分级间CyclinD1蛋白表达存在显著性差异 (P <0 .0 1)。胶质瘤细胞CyclinD1与PTEN蛋白表达呈显著性负相关关系 (r=- 0 .5 4 3,P <0 .0 1)。结论　PTEN蛋白表达可能在胶质瘤细胞周期调节和细胞增殖中发挥重要作用     

AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建人AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表达载体AChR-IgG Fc/pAN1782并在CHOk1细胞中表达AChR-IgG Fc融合蛋白。方法以人烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)α1亚基全序列为模板,以PCR法扩增AChRα1亚基胞外段主要免疫区基因片段Hα1-121,将其插入真核表达载体pAN1782。将构建的新载体转染至CHOk1细胞,建立稳定表达AChR-IgG Fc融合蛋白的CHOk1细胞株,以Western blot法检测AChR-IgG Fc融合蛋白表达。结果 (1)Hα1-121经PCR法扩增后所获428 bp基因片段大小符合预计结果,测序所得核苷酸序列与人类基因库中AChRα1亚基胞外段基因片段Hα1-121序列完全一致,未出现点突变或移码突变。所构建的新载体经酶切鉴定证实片段插入正确,载体构建成功。(2)Westernblot法检测结果显示转染新载体的CHOk1细胞培养上清液中有AChR-IgG Fc融合蛋白表达。结论成功构建人AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表达载体,且该融合蛋白可在转染新载体的CHOk1细胞中稳定表达,为下一步靶向B细胞治疗重症肌无力奠定了初步良好基础。     

NT4-NAP融合基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

神经营养因子作为神经保护剂用于治疗中枢神经系统变性疾病已得到了广泛关注，但因其均为大分子蛋白质而难以通过血脑屏障的特点限制了临床应用。近年来小分子肽被认为可能成为它的替代品。活性依赖性神经保护蛋白(activity-dependent neuroprotective protein，ADNP)是一种由血管内皮肠     

Flavopiridol对大鼠局灶性脑缺血后神经元cyclinD1蛋白表达的影响

目的 观察大鼠局灶性脑缺血后神经元内细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达与神经细胞凋亡的关系以及Flavopiridol对其的影响.方法 采用线栓法大鼠大脑中动脉持续栓塞模型,应用免疫组化和TUNEL染色方法 观察缺血组、Flavopiridol治疗组(分高剂量FH组和低剂量FL组)和假手术组神经元阳性细胞染色数量及分布情况.结果 cyclin D1蛋白和凋亡细胞分别自缺血后6h和12h开始表达,前者缺血后48h达高峰;后者缺血后72h达高峰,FH组和FL组各相应时间点cyclin D1蛋白表达均明显减少(P<0.01);FL组各相应时间点凋亡细胞明显减少(P<0.01),FH组仅在缺血48h凋亡细胞明显减少.相邻切片可见cyclin D1蛋白表达和凋亡细胞染色区域基本相同.结论 cyclin D1的蛋白表达可能诱发缺血神经细胞的凋亡,Flavopiridol通过抑制cyclin D1的表达而减少缺血后神经细胞的损害,但同时Flavopiridol本身也可能引起神经细胞凋亡.     

NT4-Al融合基因原核表达载体的构建

目的构建神经营养素（NT4）与肿瘤血管抑制肽Alphastatin融合基因的原核表达载体pBV220-NT4-Al。方法采用非对称互补引物（模板）法,依据GenBank提供的Alphastatin基因序列,设计合成并扩增出肿瘤血管抑制肽Alphastatin的cDNA;将其连接到NT4的信号肽和前导序列3’端,组成融合基因NT4-Al,再将该融合基因亚克隆于表达载体pBV220,构建pBV220-NT4-Al。结果经DNA测序、限制性内切酶酶切等方法证实Alphastatin成功重组到NT4信号肽和前导序列3’端,并将融合基因亚克隆于pBV220内。结论成功构建原核表达载体pBV220-NT4-Al,为进一步研究肿瘤基因治疗奠定了基础。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。 目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。 方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。 结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

人NR2B基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人NR2B基因,构建其真核表达载体,获得暂态表达NR2B的CHO细胞.方法 RT-PCR方法克隆人NR2B基因,并插入真核表达载体pcDNA3.1中,将该重组载体转染至CHO细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光鉴定细胞中NR2B的表达,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 成功获得人NR2B基因,转染的CHO细胞可检测到NR2B的表达,表达NR2B的CHO细胞并不会凋亡.结论 成功克隆和构建了人NR2B基因的真核表达载体,并在CHO细胞中得到了表达.     

pEGFP-ING4真核表达载体的构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的构建携带生长抑制因子4(ING4)基因的真核表达载体pEGFP-ING4并转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),为进一步研究ING4对胶质瘤血管生成影响提供基础。方法提取人胎盘细胞中总RNA,RT-PCR扩增ING4并克隆至pEGFP-C2载体,酶切电泳鉴定出阳性克隆送测序,利用靶向转染试剂jetPEI-HUVEC转染HUVEC,通过免疫组化检测转染细胞中ING4的表达。结果 成功扩增ING4基因,基因全长747 bp。重组质粒pEGFP-ING4的酶切鉴定及测序结果均证明ING4基因成功克隆到真核表达载体中。酶切片段电泳结果表明:目的条带与ING4的开放读码框大小相符;测序结果和ING4的开放读码框比对相似性为100%。转染重组质粒后的HUVEC中ING4蛋白表达水平增强。结论本实验成功构建携带ING4基因的真核表达载体pEGFP-ING4,并可在HUVEC中获得ING4蛋白的增强表达。     

NT4-A1融合基因原核表达载体的构建

目的 构建神经营养素(NT4)与肿瘤血管抑制肽Alphastatin融合基因的原核表达载体pBV220-NT4-A1.方法 采用非对称互补引物(模板)法,依据GenBank提供的Alphastatin基因序列,设计合成并扩增出肿瘤血管抑制肽Alphastatin的cDNA:将其连接到NT4的信号肽和前导序列3'端,组成融合基因NT4-A1,再将该融合基因亚克隆于表达载体pBV220,构建pBV220-NT4-A1.结果 经DNA测序、限制性内切酶酶切等方法 证实Alphastatin成功重组到NT4信号肽和前导序列3'端,并将融合基因亚克隆于pBV220内.结论 成功构建原核表达载体pBV220-NT4-A1,为进一步研究肿瘤基因治疗奠定了基础.     

含绿色荧光蛋白基因优化新型HIV-1慢病毒载体的构建及表达

The human immunodeficiency virus (HIV) lentiviral vector is an ideal vector for gene therapy. In the present study, the wild-type HIV-1 genome was segregated into four plasmids, and an optimized novel HIV-1 lentiviral vector containing green fluorescent protein and vesicular stomatitis virus G pseudo-capsule was constructed. The plasmids were pHR-CMV-EGFP, pCMVΔ8.9, pRSV-Rev, pCMV-VSV-G. The four plasmid system was co-transfected into 293T cells, and green fluorescent protein expression was observed. The present study obtained lentiviral particles by high-speed centrifugation, and the lentiviral particle titer was 4 × 108 TU/mL after centrifugation. Thus, an optimized novel HIV-1 lentiviral vector was successfully constructed.     

C-reactive protein increases plasminogen activator inhibitor-1 expression in human endothelial cells

C-reactive protein (CRP) is an inflammatory marker which predicts cardiovascular disease. However, it is not fully understood whether CRP has direct effects on endothelial functions and gene expression. The purpose of current study was to determine the effects and molecular mechanisms of CRP on the expression of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in human endothelial cells. Human coronary artery endothelial cells (HCAEC) were treated with CRP at clinically relevant concentrations for different durations. PAI-1 mRNA, protein and enzyme activities were studied. The effects of CRP on MAPK p38 phosphorylation was also studied by Bio-Plex luminex immunoassay. In addition, other types of human endothelial cells isolated from umbilical vein, skin, and lung microvessels were tested. CRP significantly increased PAI-1 mRNA levels in a time- and concentration-dependent manner. The protein level and enzyme activity of PAI-1 in the supernatant of CRP-treated HCAEC cultures were significantly increased. Anti-CD32 antibody effectively blocked CRP-induced PAI-1 mRNA expression. In addition, CRP significantly increased CD32 mRNA levels and enhanced phosphorylation of MAPK p38. Furthermore, antioxidant curcumin dramatically inhibited CRP-induced PAI-1 mRNA expression. The effect of CRP on PAI-1 expression was also confirmed in other types of human endothelial cells. In conclusion, CRP significantly increased the expression of PAI-1 in HCAEC and other human endothelial cells. CRP also increased its receptor CD32 expression which may further enhance its action. CRP-induced PAI-1 expression may be mediated by oxidative stress and p38 signal pathway as antioxidant effectively blocks the effect of CRP on HCAEC.