PCR检测细菌16s rRNA基因在临床感染性疾病诊断中的应用

目的 建立检测临床常见细菌16 s rRNA基因的PCR方法.方法 分析细菌16 s rRNA基因保守区,设计通用引物对7种常见细菌16 s rRNA基因进行PCR扩增;并用该方法检测临床血液标本中的16 s rRNA基因表达,与传统培养方法结果进行比较.结果 7种标准菌株均出现特异阳性条带;感染性疾病血液标本16 s rRNA基因阳性表达.结论 16 s rRNA基因PCR法可用于快速检测临床细菌感染.     

16S rRNA及18S rRNA同时检测脑脊液中的病原菌

目的 提高脑脊液中病原菌的快速、准确鉴定率。方法 以细菌的保守序列16SrRNA和真菌的18SrRNA为通用引物，用多重PCR技术对标准菌株及46例中枢神经系统感染患者的脑脊液进行扩增，同时与脑脊液的培养结果进行比较。结果 标准菌株金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、化脓性链球菌及白色念球菌均出现特异条带，人白细胞DNA为阴性。46份脑脊液标本培养阳性39例，另有2例PCR阳性而培养阴性，后经诱导传代培养证实为L型金黄色葡萄球菌。PCR阳性41例，与培养分离鉴定结果符合率为100％。结论 多重PCR可快速鉴定脑脊液中病原菌，为临床及时治疗提供必要的诊断信息。     

真菌性角膜溃疡的PCR检测

目的：探讨临床拟诊为真菌性角膜溃疡PCR（polymerase chain reaction）快速检测的方法。方法：以源于医学条件致病性真菌18s rRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的标本进行PCR检测．并与培养方法进行对比。结果：在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58．33％。而经PCR扩增阳性率为86．11％。结论：真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。     

203株血培养病原菌的分布和耐药情况分析

目的：了解某院血培养阳性标本中分离的病原菌分布和耐药特点。方法回顾分析2011年10月-2013年12月某院住院患者血培养阳性标本,采用API微生物板条进行细菌鉴定;采用K-B法进行药敏试验。结果2089个血培养共检出203株病原菌,其中革兰阳性球菌113株,占55．7％;革兰阴性杆菌73株,占36．0％;真菌5株,占2．5％;革兰阳性杆菌12株,占5．9％。检出的前几位细菌分别为凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌属、克雷伯菌属和铜绿假单胞菌。结论病原菌的耐药性高,应定期检测,为临床合理使用抗生素提供参考。     

16S rRNA基因文库方法在感染标本菌群分析中的应用

目的探讨16S rRNA基因文库方法对感染标本菌群的鉴定效果。方法采集70例创伤患者的感染伤口脓液或渗出液标本,使用通用引物扩增标本中所有细菌的16S rRNA基因片段,构建16S rRNA基因文库,挑取阳性克隆测序,分析感染细菌的数量与种类。结果从150个克隆子中检测7种不同酶切类型的克隆,鉴定出7类微生物,其中屎肠球菌种类最多,占88%,坚强肠球菌比例占2%,另5类序列与非可培养细菌类群的16S rRNA基因序列相似性较高,均占2%。结论感染标本中屎肠球菌含量丰富,应用16S rRNA基因文库的方法可有效分离到感染标本中的非可培养菌。     

16S rRNA基因及多重聚合酶链式反应在新生儿败血症早期诊断中的应用研究

目的分析16S rRNA基因聚合酶链式反应(PCR)检测方法及血培养方法检测疑似新生儿败血症患儿血标本中潜在病原菌的病原学特点,并以此为基础建立一套适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系。方法建立16S rRNA通用引物PCR检测方法并检测534例疑似新生儿败血症患儿血标本,分析其病原学感染及特点,与常规血培养检测结果进行比较。建立适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系。结果 534例血标本的血培养阳性率为26%,经鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌(44.6%)、大肠埃希菌(14.4%)、无乳链球菌(8.6%)、金黄色葡萄球菌(7.9%)、肺炎克雷伯菌(5.8%)、屎肠球菌(4.3%)、其他菌株(14.4%)。16S rRNA通用引物PCR检测阳性率为37.6%,显著高于血培养检测(P<0.05)。经优化的多重PCR体系可快速准确检测败血症常见菌种。结论 16S rRNA基因PCR方法用于新生儿败血症的检测具有较高的检出率,可用于临床新生儿败血症的快速诊断。本研究初步建立的败血症常见致病菌特异性引物多重PCR体系具有一定的临床应用价值。     

噬菌体生物扩增法快速检测痰结核分枝杆菌的临床应用

目的：评价噬菌体生物扩增法（PhaB）检测痰中结核分枝杆菌的应用价值。方法：应用PhaB法、BACTEC MGIT960法检测105例痰标本中结核分枝杆菌。结果：PhaB法、BACTECMGIT960法阳性标本例数分别为944、41;以培养结果为评价标准,PhaB的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为87．8％、87．5％、81．8％、91．8％。结论：PhaB测定痰中结核菌只需18～24h,具有较高的敏感性和特异性,可作为临床结核分枝杆菌的快速检测方法。     

PCR-RFLP分析16s-23srDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的探讨16S～23srDNA间区序列DNAPCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法对19种分枝杆菌标准株的16S～23SrDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSP1消化反应，分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异。结果，PCR扩增结果显示：分枝杆菌一般扩增出1～2条带，缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP，快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575bP，单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33．3％的受试菌种，酶切结果显示：分枝杆菌的酶切图谱彼此不同。结论16S～23SrDNA间区序列DNAPCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。     

RFLP技术检测和鉴定血液中念珠菌的研究

目的早期、快速检测和鉴定血液中常见念珠菌。方法对制备的白色念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌感染的血液模拟标本采用常规血培养法和限制性片段长度多态性分析(RFLP)法进行检测和鉴定,最后进行结果分析。结果RFLP技术的检出率明显高于常规培养法。结论该技术具有快速、敏感、不需放射性同位素等优点,而且准确性极高,有着较好的临床应用前景。此技术应用于临床将为血液病、肿瘤和免疫抑制患者的诊断和救治工作起到积极的作用。     

多重聚合酶链反应快速鉴别葡萄球菌及mecA基因检测

目的：建立快速鉴定葡萄球菌及检测mecA基因的多重聚合酶链反应（PCR）诊断方法。方法：以葡萄球菌16SrRNA、金黄色葡萄球菌的nuc基因以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的mecA基因合成3对引物，采用多重PCR扩增法，快速鉴定葡萄球菌，同时判断MRS菌株。结果：107株葡萄球菌的16SrRNA基因扩增片段全部为阳性．与常规鉴定结果符合率为100％；nuc基因阳性48株。阴性59株，与金黄色葡萄球菌核酸酶试验一致；以PBP2a乳胶凝集试验结果为金标准，苯唑西林（含2％NaClMHA）及头孢西丁纸片扩散法的敏感性为98．7％和100％，特异性分别为75．0％和82．1％：PCR扩增法的敏感性和特异性均为100％。结论：多重PCR法能快速准确地从临床分离菌株中鉴别葡萄球菌，并可同步对mecA基因进行准确检测。     

聚合酶联法检测产毒素霍乱弧菌

目的：研究快速、特异、灵敏的检测携带肠毒素基因的霍乱弧菌的聚合酶链法检测技术，应用于突发霍乱疫情现场和各类食品样本中霍乱弧菌的的快速检测。方法：选择霍乱弧菌肠毒素基因上的CTBAB亚单位中稳定区的核苷酸序列制备成霍乱毒素的特异性引物，对O1群(稻叶、小川)、O139群霍乱弧菌标准菌株及本地流行株和60份可疑样本检测，进行PCR实验。通过稀释比较法和定时增菌培养检测法，将PCR方法与培养法、免疫胶体金膜层析法的灵敏性与特异性进行比较。结果：细菌经稀释10～一10。以后仍PCR检测阳性，PCR的检测灵敏度为1个DNA考贝。免疫胶体金膜层析法的检测限为10^6／ml，并存在一定程度的假阳性。霍乱标准菌株均在546bp处出现CTBAB亚单位基因扩增产物，可疑样本均未检测CTBAB亚单位基因产物，与培养结果符合。选择其他肠道传染病病原菌进行特异性实验，证实霍乱弧菌CTBAB亚单位基因引物的特异性，应用常规培养法、一次性快速纸片法、3种方法对60份可疑样本检测证实，PCR方法的特异性与培养法一致，PCR法的特异性超过免疫胶体金膜层析法。检测灵敏度实验该引物对霍乱弧菌的检测敏感基线为1个DNA考贝。结论：该实验整个过程仅需4-6小时，适用于疫情现场对霍乱弧菌的快速仪器检测。     

儿童血培养阳性标本病原菌分布及耐药性分析

目的：了解儿童血培养病原菌分布状况,并探究常见病原菌对抗菌药物的耐药性。方法儿科住院患儿血培养阳性标本（1700份）分离出的病原菌258株为研究对象,采用全自动细菌鉴定仪对菌种进行鉴定,并利用K-B纸片法开展细菌药敏试验,观察药敏结果。结果血培养标本阳性检出率为15.17%,其中革兰阳性球菌占64.73%,革兰阴性杆菌占32.56%,真菌2.71%;革兰阳性菌对青霉素的耐药性最高,其次为苯唑西林、头孢唑林等;革兰阴性杆菌对氨曲南的耐药性最高,其次为头孢噻肟、头孢哌酮等。结论儿科住院患儿血培养阳性标本分离的病原菌多为革兰阳性菌,要从血培养药敏结果出发,提高抗菌药物合理利用水平,降低耐药株形成。     

熔解曲线分析检测临床常见4种革兰阳性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测4种临床常见革兰阳性病原菌,为临床感染性疾病的诊疗提供快速、敏感的分子生物学检测信息.方法 选取临床最常见的革兰阳性病原菌:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌做为本课题研究的检测菌种.根据检测菌种的不同,分别选取不同菌种的特异性靶序列,设计种特异性引物.对种特异性引物分别用标准菌株、临床分离目标菌株、临床分离非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA进行常规PCR扩增以及扩增产物测序,验证引物的特异性.对目标菌种引物进行荧光PCR预实验,筛选Tm值差异较大的多对引物,进行熔解曲线分析法实验,并对熔解曲线法的反应条件与反应体系进行优化.对优化后的熔解曲线法进行特异性验证.通过检测加入人血液中的不同细菌浓度对该方法进行敏感性分析.应用所构建的方法分别检测临床分离目标菌种各20株,分析每种菌种的熔解曲线图,熔点温度(Tm值)及其标准差(SD)的变化,评价所构建方法的稳定性.结果 ①对所设计的种特异性引物经常规PCR扩增产物电泳分析显示,目标菌株均有目的特异性扩增产物,非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA未出现特异性电泳条带.特异性扩增产物测序所得序列比对分析显示与目的菌种序列相符.②对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌的4对引物同时进行熔解曲线分析和mecA基因熔解曲线分析的条件优化结果:预变性温度94℃、120s,变性温度94℃、20s:退火温度53℃、12s;延伸温度68℃、13s;扩增循环数为40个循环,熔解曲线分析温度75℃～95℃.最佳的引物浓度为300nmol/L.③所建立的方法经特异性分析显示,上述4种目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为81.02℃;80.32℃;82.37℃:83.10℃,峰高(cm)/峰宽(cm)均大于2.6,以此为典型的熔解曲线判断标准,则非目标菌、非细菌性病原体以及人源基因组DNA分析未见典型的熔解曲线.④方法的敏感性分析显示,上述4种目标菌和mecA基因可检测到的血液细菌浓度依次为:550、520、470、500与203CFU/mL.⑤对上述4菌和MRSA的临床分离菌各20株进行检测,结果显示,其平均Tm值依次为(80.96±0.688)℃,(80.20±0.729)℃,(82.42±0.599)℃,(83.20±0.713)℃和(80.11±0.15)℃.结论 本研究所设计的针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和mecA基因检测引物具有较好的菌种特异性,可用于相应病原菌熔解曲线分析法的建立;所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测;但葡萄球菌属内和肠球菌属内的Tm值较接近,必要时,可进一步用单对引物检测分析以鉴定到种.     

酶免疫法检测儿童粪便幽门螺杆菌抗原63例

目的探讨酶免疫法检测儿童幽门螺杆菌粪便抗原(HpSA)在诊断幽门螺杆菌(Hp)感染中的价值。方法用酶免疫法检测63例胃部不适患者粪便标本HpSA，并同时进行传统的胃镜组织学法和快速尿素酶试验(RUT)。通过两者相比较，对酶免疫测定法进行初步评价。结果酶免疫测定法的敏感性为89．5％，特异性为83．3％，准确性为96．8％，阳性预测值为94．4％，阴性预测值为91．1％。结论酶免疫测定法检测HpSA具有较高的敏感性和特异性，而且方法简便，取材方便，并适合流行病学调查，是一项值得推广的临床检测方法。     

我院临床标本细菌分布及耐药性分析

目的对我院2001～2002各科室送检标本病原菌的分布及抗生素耐药性进行分析,为临床抗感染治疗提供参考依据。方法细菌鉴定及药敏试验采用VITEK-32全自动微生物鉴定仪,少数细菌药敏试验采用K-B法。结果两年来共分离病原菌1583株。其中革兰阴性肝菌1047株,革兰阳性球菌491株,真菌45株。在革兰阴性杆菌中铜绿假单胞菌最多,其次是大肠杆菌。革兰阳性球菌中,以凝固酶阴性葡萄球菌为主。大肠杆菌和肺炎克雷伯菌产超广谱酶(ESBLs)的细菌分别占39%和42%。革兰阴性杆菌对亚胺培南较敏感,铜绿假单胞菌耐药性最强,革兰阳性球菌对万古霉素最敏感,屎肠球菌耐药性较强。结论两年我院主要病原菌构成比与国内省级医院大致相同。医院感染的多重耐药相当严重,加强病原菌分布及耐药性检测,对指导临床合理用药具有重要意义。     

常见病原菌耐药监测及抗菌药物应用对策

目的：对常见病原菌进行耐药性监测，为临床合理制订用药方案提供依据。方法：从临床送检标本中分离出病原菌，用全自动细菌鉴定及药敏测定仪进行耐药性监测。结果：临床常见病原菌依次为铜绿假单胞菌(21．04％)、金黄色葡萄球菌(SA，19.24％)、大肠埃希菌(14．12％)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS，12．00％)、鲍曼不动杆菌(5．40％)、肠球菌(2．43％)及肺炎克雷伯菌(2．25％)。常见病原菌对临床常用多种抗菌药物耐药率达40％以上，SA和CNS对苯唑西林耐药率分别达79.43％、63．91％，仅万古霉素和亚胺培南分别对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌表现优秀。结论：某些传统用药观点必需改变，进行病原菌耐药监测，掌握常见病原菌耐药特点，对合理使用抗菌药物尤为重要。     

血液标本培养5400例耐药性分析

目的分析血液标本培养中病原菌的种类和耐药情况。方法对5400份血培养标本结果进行回顾性分析,采用BACTEC9120全自动血培养仪进行血培养,分离出的病原菌采用Phoenix100全自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定及耐药情况分析。结果5400份血培养标本中共检出细菌594株,血培养阳性检出率为11．0％;其中革兰阴性菌317株,占53．4％;革兰阳性菌261株,占43．9％;深部真菌16株,占2．7％。检出的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌和肺炎克雷伯菌。主要革兰阳性球菌对万古霉素全部敏感。结论血培养分离的病原菌以革兰阴性菌为主,金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌是败血症和菌血症主要病原菌,病原菌耐药情况严重。     

微生物全自动仪器联合快速检测儿童血液致病菌的分析

目的针对探讨儿童血培养的细菌检测和鉴定的快速方法。方法用法国生物梅里埃公司提供的儿童专用血培养瓶PF,经BacT/Alert3D仪检测生长细菌的阳性标本,从中提取菌体后,直接用WALKAWAY96/PIUS自动化仪器仪进行细菌鉴定(直接法),同时转种培养基平板,用分纯的菌落进行自动化仪器法的细菌鉴定(标准法),比较两法的符合率。结果直接法共鉴定了50份模拟标本和42份临床血液标本的细菌,与标准法对照,模拟标本50份,革兰阴性杆菌总符合率88.28%,革兰阳性球菌符合率为80.00%,总符合率为88.00%。临床标本42份,革兰阴性杆菌总符合率90.48%,革兰阳性球菌符合率为80.92%,总符合率80.90%。结论联合应用BacT/Alert3D仪和WALKAWAY自动化仪器仪,可以缩短血液培养的细菌检测和鉴定时间。直接法鉴定革兰阴性的肠杆菌科细菌,结果满意。     

高龄患者医院获得性肺炎的病原菌构成及耐药性分析

目的探讨高龄患者医院获得性肺炎（HAP）常见病原菌构成及其耐药情况。方法对2011年1月-2012年4月本院综合病房收治的198例高龄HAP患者痰标本中分离出的病原菌进行细菌鉴定,采用Kirby—Bauer法检测其耐药性。结果分离出病原菌共308株,革兰阴性细菌187株（60．71％）,革兰阳性细菌94株（30．52％）,其中MRSA34株,占所分离金黄色葡萄球菌的73．91％,真菌27株（8．77％）。前4种病原菌分别为铜绿假单胞菌（21．75％）、金黄色葡萄球菌（14．94％）、大肠埃希氏菌（12．66％）和肺炎克雷伯菌（11．04％）,且普遍呈现多重耐药。结论高龄患者HAP病原菌以革兰阴性菌为主,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及条件致病菌的分离率及耐药率有增加趋势,建立细菌耐药预警机制,早期、规范使用抗生素意义重大。     

POR-RFLP分析16s～23s rDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的 探讨16s～23s rDNA间区序列DNA PCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值.方法 对19种分枝杆菌标准株的16s～23s rDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶Hae Ⅲ、MSP1消化反应,分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异.结果 PCR扩增结果显示:分枝杆菌一般扩增出1～2条带,缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP,快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575 bP,单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33.3%的受试菌种,酶切结果显示:分枝杆菌的酶切图谱彼此不同.结论 16s～23s rDNA间区序列DNA PCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法.