核心结合因子α1在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达

目的：观察核心结合因子α1（cbfα1）在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达情况，为进一步研究cbfα1在牙胚发育，尤其是成牙本质细胞分化过程中的作用奠定基础。方法：通过瞬时转染、免疫荧光染色、Western blot等方法，研究转染或BMP-2刺激时，cbfα1在MDPC-23细胞中的表达情况。结果：在普通MDPC-23细胞中未发现cbfα1的表达；转染pcDNA3．cbfα148h后，cbfα1表达量最高；加入骨形态发生蛋白-2（BMP-2）刺激，可诱导内源性cbfα1的表达，但表达量小于pcDNA3-cbfα1组；而pcDNA3-cbfα1组和BMP-2＋pcDNA3-cbfα1组的cbfα1表达量差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：转染pcDNA3-cbfα148h后，cbfα1表达量最高，可作为今后研究的观测点。     

肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法 使用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α对netrin-1表达影响。PCR反应克隆出netrin-1启动子序列,构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶报告基因表达载体。转染HEK-293A细胞检测荧光素酶活性。观察细胞因子TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 首先证实了TNF-α能够上调Netrin-1的表达。其次成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性。发现肿瘤坏死因子TNF-α可以使netrin-1启动子活性显著增加 (P<0.05),TNF-α以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）过表达牙本质涎磷蛋白（DSPP）后的形态学改变，并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC，通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC，通过标记基因GFP检测转染效率，观察转染后细胞的形态学改变，RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC，经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42．7％，转染后的细胞出现分化，似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1／2、Pax9、Lhx6／7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col Ⅰ等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化，并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)过表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)后的形态学改变,并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC,通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC,通过标记基因GFP检测转染效率,观察转染后细胞的形态学改变,RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC,经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42.7%,转染后的细胞出现分化,似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1/2、Pax9、Lhx6/7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化,并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

炎性刺激下张应力对成骨细胞核心结合因子α1表达的影响

目的 观察成骨细胞在牙龈卟啉菌脂多糖(Pg-LPS)刺激单核巨噬细胞上清培养下张应力对其核心结合因子α1 (Runx2/Cbfα1)表达的影响.方法 成骨细胞MC3T3-E1于Pg-LPS刺激单核巨噬细胞上清培养24 h后,应用四点弯曲加力装置对细胞分别加载1000μstrain和3000μstrain循环单轴张应...     

核心结合因子α1过表达慢病毒载体的构建及其在人牙周膜成纤维细胞中的表达和意义

目的 构建含人核心结合因子α1(CBFα1)基因的过表达慢病毒载体,并观察在重组慢病毒感染的人牙周膜成纤维细胞(PDLFs)中CBFα1基因的表达情况.方法 采用PCR 技术体外扩增人CBFα1,将扩增产物与慢病毒载体pGC-FU连接,构建重组质粒pGC-FU-hCBFα1,并进行酶切及测序鉴定.利用脂质体转染法将pGC-FU-hCBFα1、pHelper1.0和pHelper2.0的3种质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒.将PDLFs分为未感染组(未感染任何病毒)、阴性对照病毒感染组(加阴性对照病毒感染)、CBFα1重组慢病毒感染组(加CBFα1重组慢病毒感染),应用免疫细胞化学方法检测目的 基因CBFα1在PDLFs中的表达.结果 重组质粒经测序证实,插入片段与人CBFα1基因序列完全一致.包装慢病毒后检测病毒滴度为2.00×109 TU/ml.免疫细胞化学检测证实了CBFα1在PDLFs中的有效表达.结论 成功构建了携带hCBFα1基因的重组慢病毒,并能有效感染PDLFs,为进一步研究其在牙周组织再生中的生物学功能奠定了基础.     

SP1调控PIWIL1基因启动子转录活性研究

目的 克隆转录因子SP1编码序列,构建真核表达质粒PCDNA3.1-SP1,并研究其对PIWIL1基因转录活性的影响。方法 RT-PCR法从正常人外周血总RNA中钓取SP1基因的编码序列,插入至真核表达载体PCNDA3.1（+）,酶切及测序鉴定重组质粒。Western blot法分别验证重组表达载体的在COS-7细胞中的表达效应。分别将活性最高的PIWIL1基因启动子报告基因截短体（即核心启动子区域）、活性最低的PIWIL1基因启动子报告基因截短体,与SP1重组质粒共转染COS-7细胞,利用Dual-Luciferase reporter assay system测定不同启动子活性区的PIWIL1基因转录活性的改变,同时应用光辉霉素A下调SP1的表达来进一步验证SP1对PIWIL1活性的影响。结果 酶切及测序鉴定结果显示SP1表达质粒构建成功,Western blot法结果表明重组SP1表达载体能有效表达于COS-7细胞,过表达SP1可明显提高PIWIL1不同活性区的启动子的活性（P<0.05）。结论 外源性SP1真核表达载体转染能有效表达于COS-7细胞,并对PIWIL1的转录活性起着上调的作用,提示SP1可能是PIWIL1转录活性的正调控元件之一。     

炎性刺激下张应力对成骨细胞核心结合因子α1表达的影响

目的观察成骨细胞在牙龈卟啉菌脂多糖(Pg-LPS)刺激单核巨噬细胞上清培养下张应力对其核心结合因子α1(Runx2/Cbfα1)表达的影响。方法成骨细胞MC3T3-E1于Pg-LPS刺激单核巨噬细胞上清培养24h后,应用四点弯曲加力装置对细胞分别加载1000μstrain和3000μstrain循环单轴张应力0h、0.5h、1h、2h、3h、6h,采用实时荧光PCR检测细胞Runx2/Cbfα1mRNA的表达差异性。同时设非炎性刺激组为对照组。结果机械牵张力刺激下,炎性刺激组细胞和非炎性刺激组细胞Runx2/Cbfα1mRNA表达趋势相似,0.5h后升高,6h最高;炎性刺激组细胞各时点Runx2/Cbfα1mRNA表达低于非炎性刺激组(P<0.05);不同应力作用下,前3h细胞Runx2/Cbfα1mRNA表达未见明显差异,6h时3000μstrain组细胞表达高于1000μstrain组(P<0.05)。结论炎症刺激可抑制应力下成骨细胞Runx2/Cbfα1的表达,提示临床上对牙周炎静止期患者施力需谨慎。     

高磷对大鼠血管平滑肌细胞钙化及核心结合因子α1表达的影响

[目的]研究高磷对体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙沉积以及核心结合因子α1 (Cbfα1)的影响.[方法] 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,根据培养基中磷浓度分为:正常磷浓度(磷浓度1.4 mmol/L)和高磷浓度(磷浓度2.4 mmol/L)组,培养第3 d、6 d、9 d后,BCA法检测细胞内钙含量,放射免疫方法检测培养液骨钙素含量,ELISA检测细胞Cbfα1与DNA结合活性.[结果] 正常磷浓度组VSMCs钙含量在9 d内无明显变化.高磷浓度组第3、6、9天细胞钙含量比第0天明显增高(P<0.01).高磷浓度组细胞钙含量在第3、6、9天均明显高于相同时间点正常磷浓度组(P<0.05).培养3 d后,高磷浓度组培养上清液骨钙素水平明显高于正常磷浓度组,(14.62±2.93)pg/μg蛋白vs (2.83±0.64)pg/μg蛋白,P<0.01.Cbfα1活性在正常磷浓度组细胞9 d内无明显变化;但在高磷浓度组6、9天与第0天比明显增强(P<0.05).高磷浓度组在第6、9天细胞Cbfα1活性与相同时间点正常磷浓度组比明显增强(P<0.05).[结论] 高磷可直接刺激大鼠VSMC的钙沉积和骨钙素产生,其作用可能与高磷上调VSMC的Cbfα1表达有关.     

核心结合因子α_1基因修饰MSCs对骨质疏松大鼠骨形成作用研究

目的:以去势大鼠建立绝经后骨质疏松模型,探讨以核心结合因子α1(Cbfα1)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞,对绝经后骨质疏松症骨形成的刺激作用和基因治疗机制。方法:54只SD雌性大鼠随机分为三组:去势后给药实验组(Cbfα1基因修饰MSCs植入组:(G1),去势组(G2)和对照组(G3),并将术后第4、10和16定为实验周。观测骨形成指标:骨钙素(BGP)、骨特异性碱性磷酸酶(骨AKP)和总碱性磷酸酶(总AKP)和骨吸收指标:尿吡啶醚(PYD)和脱氧吡啶醚(DPD)以及骨生物力学检测(BMT)。同步用IBAS计算机全自动图像分析系统对不脱钙骨组织动态观测骨形态计量学参数。结果:G1在去势后4～16周BGP和骨AKP明显高于G2。而骨吸收指标:尿PYD和DPD两组间无显著差异。骨形成表面(FS)和骨小梁体积比(TBV),骨小梁平均厚度(MTT)较G2明显升高,尤其是TBV和FS,这种差异在第10周最为显著。随着给药时间的延长(第16周)骨矿化沉积速率(MAR)逐渐增加。骨吸收表面(RS)与G2比较在所有实验周均无差异。BMT值4～16周明显高于G2。结论:Cbfα1基因修饰MSCs可刺激骨质疏松大鼠成骨细胞活跃增生,促进骨形成与骨转换速率代谢平衡。并可使骨质疏松大鼠骨组织微观结构改善。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

人Mcl-1基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的:对人Mcl-1基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法:从Gene Bank数据库中获取人Mcl-1基因5'调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果:Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在1700、1147、368和32个可能的转录因子结合位点,包含Arid3a,Atoh1,ETV6,Gata1,GATA3,KLF5,LMX1A,LMX1B,MZF1,Prrx2,SPI1,TBX4,USF1,YY1,ZEB1等。结论:人Mcl-1基因5'调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与肿瘤发生,红细胞生成及神经发育等有关。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

雌二醇对骨髓基质细胞核结合因子α1基因表达的影响

目的: 研究骨髓基质细胞(MSCs)在向成骨细胞(OB)分化的条件培养体系中,17β-雌二醇(E2)对其核结合因子α1(core binding factor α1, Cbf α1)基因表达的影响,探讨E2对OB生成的作用及绝经后高转换骨代谢的可能机制. 方法: 取自3 mo龄雌性SD大鼠MSCs在生长培养基中传代后,用1,25(OH)2D3和地塞米松(DEX)诱导MSCs向OB分化. 应用半定量RT-PCR技术,观察不同浓度E2对MSCs分化过程中Cbf α1 mRNA表达的影响;以α-磷酸奈酚为底物,测定细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性;Van Gieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量. 结果: E2能明显抑制MSCs分化过程中Cbf α1 mRNA的表达,从(23.4±1.8)%降至(15.8±1.5)%和(5.8±0.8)%(P<0.05);细胞ALP活性随E2浓度增加而降低,从 (706±37) nkat@g-1(protein)降至(63±5)nkat@g-1(P<0.05). E2降低细胞Ⅰ型胶原的合成,用Van Gieson染色细胞,随着E2浓度的增加,胞质染色由鲜红、淡红到黄色. 结论: E2能明显抑制MSCs分化过程中Cbf α1 mRNA的表达,减少OB的生成.     

Nox1基因启动子表达载体的构建

目的 克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)上游启动子序列,为研究Nox1基因的转录调控奠定基础.方法 以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1 415 bp(-1415～0)、1 276 bp(-1415～-140)、997 bp(-1415～-419)、839 bp(-1415～-577)、470 bp(-1415～-946)大小的Nox1启动子片段,将其定向克隆人pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性.结果 在A549细胞中,各Nox1启动子片段均有活性;-140～-419 bp和-577～-946 bp区域可能存在Nox1启动子核心区域.结论 成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Nox1启动子序列,为进一步研究Nox1基因的转录调控机制奠定了基础.     

熟地、鳖甲对大鼠成骨细胞增殖、碱性磷酸酶蛋白和核心结合因子α1 mRNA表达的影响

目的观察熟地、鳖甲含药血清对大鼠成骨细胞增殖和功能的影响。方法雄性SD大鼠随机分为3组后,分别灌服高浓度熟地、鳖甲煎剂(3.25 g/kg)、低浓度熟地、鳖甲煎剂(1.625 g/kg)及等量容积的蒸馏水,连续灌胃3 d,制得大鼠高、低剂量熟地、鳖甲含药血清及空白对照血清。原代培养并传至第3代经碱性磷酸酶鉴定取得的大鼠成骨细胞,消化计数铺板并分为3组,以上述血清处理72 h,MTT法检测成骨细胞的增殖率,ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)分泌量并以相应OD值进行纠正,并且运用实时荧光定量PCR检测各组成骨细胞核心结合因子α1(Cbfα1)mRNA表达情况。结果低剂量含药血清组成骨细胞增殖率、ALP浓度及Cbfα1 mRNA表达量明显高于其他2组。结论熟地、鳖甲可能是通过提高成骨细胞的增殖潜能而起骨保护作用的。     

骨肉瘤中核心结合因子a1基因的定量测定及其意义

核心结合因子 a1(Cbfa1)又称成骨细胞特异性转录因子 2 (Osf2 ) ,是近年来发现的成骨细胞分化的重要调节因子 ,仅在成骨细胞和骨细胞中表达 [1 ,2 ] 。骨肉瘤由分化程度不同的成骨细胞组成 ,发生于间质细胞向成骨细胞系分化过程中 ,肿瘤细胞能直接产生骨质或类骨质。本研究采用实时荧光定量 PCR方法测定骨肉瘤标本中 Cbfa1m RNA的表达并探讨其临床意义。1　材料和方法1.1　临床资料　手术切除骨肉瘤标本 12例 ,其中男 9例 ,女 3例 ,平均年龄 2 2 .5岁 ;10例为普通中心型骨肉瘤 ,2例为小细胞型骨肉瘤 ;标本中 8例取自长海医院 ,4例取自解…     

L-精氨酸对血管钙化大鼠核心结合因子1表达的影响

目的探讨L-精氨酸（L-arginine,L-Arg）对大鼠血管钙化的作用及其机制。方法利用维生素D3、尼古丁制备大鼠血管钙化模型,并将大鼠随机分为6组：对照组（CON）、钙化组（VDN）、L-NAME组（L-NA）、钙化＋L-NAME组（VLN）、钙化＋低剂量L-Arg组（VLA）、钙化＋高剂量L-Arg组（VHA）。常规饲养6周后采集标本,胸主动脉行Von Kossa染色,用原子吸收分光光度法检测大鼠血管组织钙含量、碱性磷酸酶活性及NO含量,western blot技术检测核心结合因子1（core binding factor-1,cbfα1）的表达。结果 VonKossa染色,VDN组明显见到钙化颗粒,并成片状,使用L-Arg干预后钙化颗粒明显减少;VDN组的血管组织钙含量、碱性磷酸酶活性较CON组均明显增加（P〈0.05）,VLA与VHA组血管组织钙含量、碱性磷酸酶活性均较VDN组明显降低（P〈0.05）;VDN组血管组织NO含量较CON组明显减少（P〈0.05）,VLA与VHA组均较VDN组升高（P〈0.05）;western blot检测表明,VDN组cbfα1表达水平较CON组明显升高（P〈0.05）,VLA与VHA组较VDN组明显降低（P〈0.05）。结论 L-Arg可能通过降低核心结合因子1的表达起到减轻血管钙化的作用。     

核心结合因子α1过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建含人CBFα1/RUNX2基因的过表达慢病毒载体。方法采用PCR技术体外扩增人CBFα1/RUNX2,将扩增产物与慢病毒载体pGC-FU连接,构建重组质粒pGC-FU-hCBFα1/RUNX2,并进行酶切及测序鉴定。鉴定正确的克隆转染293T细胞,经荧光显微镜观察和Western Blot检测hCBFα1/RUNX2基因在293T细胞内的瞬时表达。再利用脂质体转染法将pGC-FU-hCBFα1/RUNX2、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR检测病毒滴度。结果重组质粒经测序证实,插入片段与人CBFα1/RUNX2基因序列完全一致。荧光显微镜观察以及Western Blot印迹均证实pGC-FU-hCBFα1/RUNX2中携有正确的hCBFα1/RUNX2基因,并能在293T细胞中瞬时表达。包装慢病毒后实时荧光定量PCR检测病毒滴度为(2.00×108)TU/mL。结论成功构建了携带hCBFα1/RUNX2基因的重组慢病毒载体,为进一步研究其在牙周组织再生中的生物学功能奠定了基础。