负载U937细胞冻融抗原的DC诱导CTL的特异性杀伤

树突状细胞 (DC)作为重要的专职抗原提呈细胞 ,其抗原提呈能力远强于巨噬细胞和B细胞等抗原提呈细胞。因而 ,以DC为中心的免疫治疗是肿瘤生物学治疗的主要方向之一。我们应用当前普遍采用的rhGM CSF、rhIL 4培养体系 ,自骨髓单个核细胞诱导产生CD14 - CD1a 的前体DC ,使其负载     

冻融抗原负载树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤急性白血病细胞的实验研究

我们应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,基因重组人粒 /单细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)联合培养体系自健康志愿者骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载急性髓系白血病 (AML)细胞冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,观察负载AML细胞冻融抗原后DC的状态对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对AML细胞特异性杀伤活性。我们发现负载AML冻融抗原后DC的CD1a、CD83、CD86、CD11C、HLA DR表达率为较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,且负载AML冻融抗原的DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例 ,较诱导前明显增高 (P <0 .0 1) ,而负载AML细胞冻融抗原的DC诱导CTL对AML细胞有较强的杀伤作用 ,明显强于加或不加IL 2培养的T细胞对照组 (P <0 .0 1) ,而对K5 6 2细胞无明显的杀伤活性。通过以上实验我们认为经rhGM CSF ,rhIL 4培养产生的DC为CD14CD1a DC ,能诱导CTL对AML细胞产生明显的特异性杀伤作用 ,另外 ,负载AML细胞冻融抗原DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例明显增高 ,提示CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。     

卵巢癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞诱导CTL抗卵巢癌免疫应答的体外研究

目的研究卵巢癌冻融抗原负载的树突状细胞(dendriticcells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤卵巢癌细胞的细胞毒性效应。方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法从卵巢癌细胞系SKOV3中提取的可溶性相关抗原负载DC。流式细胞学检测负载抗原后DC表面各种分化相关抗原的表达,ELISA法检测DC上清中IL12的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC体外刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测抗原负载DC激活的抗原特异性CTL对卵巢癌细胞的杀伤作用。结果与未经抗原负载的DC相比,经卵巢癌抗原负载的DC不仅能更高地表达各种DC分化相关抗原CD1α(73.35%±2.94%vs34.1%±2.35%)、CD83(73.9%±8.46%vs54.68%±3.26%)、CD80(91.95%±2.48%vs52.53%±3.18%)、HLADR(70.05%±2.35%vs48.7%±2.07%)以及CD54(88.9%±5.52%vs71.45%±2.29%),同时具有更强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖和IL12分泌的能力(P均<0.05)。此外,卵巢癌细胞SKOV3冻融抗原负载DC激活的CTL在体外对SKOV3的杀伤率为77.35%,显著高于未经抗原负载的DC(P=0.0001)。结论经卵巢癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力和杀伤卵巢癌细胞的作用。     

SP2/0细胞膜抗原负载DC诱导体外特异性CTL效应

目的 研究SP2／0细胞膜抗原负载树突状细胞（DC）诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤细胞的杀伤活性。方法 密度梯度离心法分离SP2／0细胞膜，负载经rmGM-CSF和rmIL-4诱导扩增的小鼠骨髓来源的DC，活化T淋巴细胞获得肿瘤特异性CTL，MTT法检测对SP2／0细胞的杀伤效果。结果 骨髓单个核细胞在rmGM-CSF和rmIL-4作用下获得了高表达CDS0、CD86和MHC-Ⅱ分子的DC，致敏的CTL对SP2／0骨髓瘤细胞具有高杀伤率，显著高于对I5178Y淋巴瘤细胞的杀伤活性（P〈0．01）。结论 SP2／0细胞膜抗原负载DC能诱导明显的特异性抗肿瘤免疫应答。     

负载乳腺癌细胞冻融抗原的DC对CTL体外特异性杀伤活性的影响

目的：研究乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞来源的DC,经自体肿瘤细胞冻融抗原刺激后,对CTL体外特异性杀伤活性的影响。方法：以细胞因子分别诱导、培养乳腺癌腋下淋巴结单个核细胞中的DC及TDLNC,用自体癌细胞冻融抗原刺激DC,并和TDLNC共培养,诱导成为肿瘤抗原特异性CTL;检测特异性CTL对自体乳腺癌细胞及MCF-7细胞的体外杀伤活性。结果：DC-Ag-TDLNC、DC-TDLNC和TDLNC对自体乳腺癌细胞的杀伤率分别为67.64%、31.25%和26.36%,P〈0.001;三种TDLNC细胞对MCF-7细胞的杀伤率无明显差异（P〉0.05）。结论：乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞在细胞因子的诱导、活化及自体肿瘤抗原刺激下,可分化为成熟DC,DC可促进TDLNC增殖、分化为特异性CTL,后者对自体肿瘤细胞有较高的杀伤活性。     

负载甘露糖化抗原的DC诱导的特异性杀伤

目的：探讨甘露糖化肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫中的作用。方法：纯化出目的蛋白HER-2／neu胞外配体第2结构域（RLD2），并对其进行糖基化修饰，自外周血单核细胞诱导产生CD83^＋的DC，利用DC表面的甘露糖受体，使DC负载甘露糖基化的目的抗原mRLD2（mL2），并致敏T淋巴细胞，观察CTL特异性杀伤SKBR-3细胞的效果。结果：较之未进行糖基化修饰的目的蛋白RLD2（T2），mL2能促进DC的成熟，并能诱导出具有更强杀伤效力的CTL。结论：本实验的结果为开展新型甘露糖化肿瘤疫苗的研制提供了理论依据。     

抗原基因修饰的树突状细胞诱导机体产生特异性免疫应答的实验研究

目的：探讨腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的树突状细胞（ＤＣ） 体内免疫后对抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法：以βｇａｌ 为模拟抗原,以转染有ＬａｃＺ基因并稳定表达βｇａｌ 的淋巴瘤细胞Ｅ２２ 为肿瘤细胞模型,用携带编码βｇａｌ的ＬａｃＺ基因的重组腺病毒载体（ＡｄＬａｃＺ） 转染小鼠骨髓ＤＣ,检测转染的效率及ＬａｃＺ基因修饰ＤＣ刺激Ｔ细胞增殖的能力,观察皮下免疫ＬａｃＺ基因修饰ＤＣ后小鼠引流区淋巴结细胞数量和组分的变化以及诱导产生ＣＴＬ和抵抗Ｅ２２ 细胞再攻击的能力。结果：ＬａｃＺ基因修饰后２４ 、４８ 、７２ ｈ,均能检测到８０％ 以上的ＤＣ表达βｇａｌ,此基因修饰的ＤＣ可有效刺激同基因型小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞增殖反应;将其皮下免疫小鼠１ ｗ 后再接种Ｅ２２ 细胞,小鼠的存活期较其他ＤＣ免疫小鼠显著延长,但对Ｂ１６ 黑色素瘤细胞的攻击无免疫保护作用。此外,ＬａｃＺ基因修饰的ＤＣ免疫小鼠的引流淋巴结细胞数量显著增加,且产生了针对Ｅ２２ 的而非ＥＬ４ 或Ｂ１６ 的特异性ＣＴＬ。结论：腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的ＤＣ能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。     

树突状细胞负载肝癌可溶性抗原后的免疫应答

目的 用负载肝癌可溶性抗原的DC诱导肝癌特异性T细胞。方法 在体外用GM－CSF和IL－4诱导健康人外周血单核细胞，使其分化为高纯度树突状细胞（DC）。用负载人肝癌细胞株SMMC－7721可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞。结果 诱导后淋巴细胞增殖指数大于1．5，表面CD56分子表达下降，CD3^ T/CD4^ T和CD3^ T/CD8^ T细胞比例增加，以CD3^ T/CD4^ T细胞比例增加最为明显。CD4／CD8比例由诱导前的0．84增加为1．04，活化前后γδ比例没有改变。活化后的淋巴细胞不但可杀伤SMMC－7721细胞，同时还可不同程度的杀伤其它3株肝癌细胞。另外，诱导7d的DC可不同程度的抑制4株肝癌细胞和胃癌细胞。结论 实验结果为肝癌DC疫苗的研究提供了理论基础。     

慢性肝炎患者树突状细胞体外负载抗原后的抗病毒作用

近来在抗肿瘤免疫研究中发现，树突状细胞（DC）在抗原的提呈及激活淋巴细胞使其成为肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）方面有重要作用，因而有广泛的应用价值。本研究对慢性肝炎外周血树突状细胞进行体外诱导扩增，DC在未成熟阶段摄取纯的HBsAg后发育为成熟的DC，再与自身T淋巴细胞共培养，观察特异性CTL对2．2．15细胞培养液中HBeAg和HBsAg的表达抑制以及产生IFN-γ和IL-12的情况。     

乳腺癌患者腋下淋巴结来源的DC诱导自体特异性CTL的实验研究

目的:研究乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞来源的树突状细胞(DC)诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的能力。方法:以多种细胞因子联合诱导腋下淋巴结单个核细胞中的贴壁细胞为DC,非贴壁细胞与IL-2共培养后诱导成为肿瘤区域引流淋巴结细胞(TDLNC),用自体乳腺癌细胞冻融抗原刺激DC,并和TDLNC共培养,以诱导肿瘤抗原特异性CTL。结果:淋巴结细胞经体外培养后,贴壁细胞在DC诱导前,其特异性表面标志物CD1a、CD83、CD86的百分比(%)分别为11.0±2.4、26.6±5.2和33.0±6.1,经与rhGM-CSF、rhIL-4共同培养,并经自体肿瘤冻融抗原加TNF-α诱导后3种标志物的水平升高,其百分比(%)分别为50.2±5.7、60.5±16.5和56.2±16.4(P<0.01)。TDLNC中CD3 和CD8 细胞含量(%)分别为73.9±2.2和32.8±3.2;经DC和肿瘤抗原诱导后,DC-Ag-TDLNC中的CD3 和CD8 细胞含量升高,其百分比(%)分别为82.7±2.8和62.5±2.5(P<0.01)。结论:乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞在rhGM-CSF和rhIL-4刺激活化和自体肿瘤抗原及TNF-α的诱导下,可以分化为典型的DC。成熟的DC具有较强的抗原提呈功能,可以促进TDLNC增殖、分化为抗原特异性CTL。     

Discovery of B cell antigen on blast cells of patients with chronic myeloid leukemia

The presence of a common antigen on B lymphocytes of healthy blood donors and on myeloblasts of patients with chronic myeloid leukemia (CML) in the blast crisis (BC) stage was established with the aid of an antimyeloblast serum by the indirect surface immunofluorescence test. In the cytotoxic test this antigen was found on the blast cells of 27 patients with CML in the BC stage and in three of 11 patients with acute lymphatic leukemia, in one of eight patients with chronic lymphatic leukemia, and in both of two patients with undifferentiated leukemia. No antigen was found on the peripheral blood cells of healthy donors by this test.Oncologic Scientific Center, Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow. (Presented by Academician of the Academy of Medical Sciences of the USSR L. M. Shabad.) Translated from Byulleten' Éksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 87, No. 6, pp. 574–576, June, 1979.     

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

人外周血树突状细胞-乳腺癌细胞融合细胞

目的：探讨树突状细胞—肿瘤细胞融合细胞的形态特性，为研制融合细胞疫苗提供形态学依据。方法：将免疫磁珠法分离的人外周血树突状细胞与人乳腺癌细胞株MCF7融合，瑞氏—姬姆萨染色观察；扫描电镜观察树突状细胞、融合细胞的表面超微结构。结果：树突状细胞与MCF细胞按10：1比例融合后，一个乳腺癌细胞可以与一个或多个树突状细胞相融合；扫描电镜下可见分离的树突状细胞表面有突起，树突状细胞/MCF7融合细胞具两种亲代细胞的表面超微结构特点。结论：树突状细胞与人乳腺癌细胞融合后无明显的形态改变。     

小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合的研究

目的 使肺癌细胞表达共刺激分子,探讨其作为疫苗的可能性。方法 小鼠骨髓细胞在体外经GM－CSF和TNF－α诱导,使之成为成熟树突状细胞（BmDC)。将其与小鼠Lewis肺癌细胞AL9901融合,并以S－P免疫细胞化学染色法检测融合细胞和BmDC上有关分子的表达。结果 通过GM－CSF和TNF－α诱导获得BmDC,以诱导5d时收获为佳。获得的BmDC能高表达B7－1和CD40分子,与肺癌细胞融合后,获得的融合细胞仍能高表达B7－1和CD40分子。结论 通过将小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合,使肺癌细胞获得了BmDC表达的B7－1和CD40分子,从而提高了其免疫原性,为制备肺癌疫苗奠定了基础。