丙型肝炎病毒多CTL表位DNA疫苗免疫学特性的初步研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)疫苗研制并为抗HCV感染提供实验依据。方法:从HCV J株基因组中,选取小鼠(H-2d)CTL表位基因序列,以pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建相应的真核表达质粒,经肌肉免疫后,取受免疫小鼠血清和脾细胞,用ELISA及MTT法检测小鼠血清中IL-2和IFN水平及小鼠脾细胞的增殖活性。结果:实验组小鼠血清中IL-2及IFN水平明显高于对照组[IL-2:(208±8.88)比(106±6.06);IFN:(179.5±2.52)比(90.5±2.52),P<0.05];实验组淋巴细胞增殖指数明显高于对照组(1.56比1.13,P<0.05)。结论:本实验构建的pcDNA3.1(+)/HCV CTL真核表达质粒,经肌肉免疫后可以使受免疫小鼠细胞免疫应答水平提高,淋巴细胞增殖活性增高。     

重组蛋白CTB表位对HCV多表位DNA疫苗的小鼠中免疫应答的影响

将一12aa的CTB表位连接于丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV)复合多表位抗原基因PCX的5'端,再克隆于真核表达载体pcDNA3中,获得重组质粒pcDNA3/CTB-PCX,利用表达IL-12的pWRG/mIL-12作为佐剂,肌注免疫小鼠后6W,用重组蛋白GZ-PCX加强免疫1次,第6W时可检测到较高水平的抗GZ-PCXIgG,最高滴度达1：10^3,与对照pcDNA3/PCX相比无显升高,提示CTB表位并无明显的增强PCX基因特异性体液免疫应答的作用。重组蛋白GZ-PCX可有效提高抗体水平,促进CD^8 T细胞增殖。免疫小鼠可诱发针对GZ-PCX融合蛋白的迟发性超敏反应（DTH）,免疫后小鼠体重正常,肝脾未见明显肿大。具有良好安全性。     

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

多表位疫苗生物信息学分析概述

疫苗接种是防治传染性疾病的一种有效的防治策略。安全、有效和低成本的疫苗是如今疫苗研究的追求目标。生物信息学和高通量测序的方法为疫苗研究带来了新的思路,通过生物信息学分析工具进行表位预测,分析出可以诱导有效的细胞免疫和体液免疫反应的优势表位参与疫苗构建,再综合其他方面的生物信息学技术评估最终构成新的多表位疫苗。本文主要从抗原选取、计算机表位预测、多表位的连接、蛋白三维构建及评估、分子对接、分子动力学模拟等方面对当前最主要的多表位疫苗研究策略进行综述,同时总结了多表位疫苗目前的研究情形和未来的发展。该策略已经应用于新冠病毒、疟疾及利什曼原虫等病原体的多表位疫苗研究之中。     

DNA核酸疫苗诱导小鼠免疫应答的作用

目的 研究DNA核酸疫苗诱导机体免疫应答的能力，为揭示其诱导机制奠定基础。方法 采用本室构建的单纯疱疹病毒2型（HSV－2）糖蛋白D的真核表达质粒pcDNA-gD2免疫小鼠，通过对ELISA法动态检测特异性抗体的产生及小鼠外周血Th1细胞因子IFN－γ，IL－2的水平同时进行病毒攻击实验。结果 pcDNA-gD2和HSV－2免疫组小鼠从第2周开始产生特异性抗糖蛋白D抗体，第4－5周达到高。外周血清IFN－γ，IL－2水平明显高于阴性对照组。病毒攻击实验显示2周内pcDNA-gD2和HSV－2免疫组小鼠无一只死亡，而阴性对照组小鼠全部死亡。结论 pcDNA-gD2真核表达质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和Th1型细胞免疫，并具有免疫保护作用。     

HCV高变区1串联模拟表位基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)高变区1(HVR1)串联模拟表位基因免疫在BALB/c小鼠体内引起抗体产生的特点.方法针对中国人群HCV HVR1位中6个较保守的AA位点设计并合成多肽表位,从中筛选活性最好的肽1、5、6、7构建含4条多肽编码基因的表达载体.将HCV HVR1串联模拟表位表达载体对小鼠股四头肌直接免疫,采用ELISA法检测小鼠血清内抗体的产生,并将免疫血清与一系列基于本室对HVR1氨基酸序列的分析结果合成的多肽进行反应,分析免疫血清对这些多肽的交叉反应性.结果免疫血清同编码的各合成肽都有较好的反应性,其中对肽1反应最好.免疫血清同合成的4条HVR1全序列多肽及其他非编码HVR1多肽有较好的反应性.结论基因免疫能够在小鼠体内引起表位特异性抗体的产生.此串联表位设计引起的体液免疫反应对HCV HVR1合成肽有较好的交叉免疫反应.     

IL-12对乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

目的　观察编码鼠 IL - 12的真核表达载体对 HBVDNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,EL ISA法检测小鼠血清抗 HBs,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL杀伤活性 .结果　免疫 8wk后 ,单纯注射 p CR3.1- S及共注射 IL - 12真核表达载体的小鼠血清 45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15 .CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,两组均有明显差异 (P<0 .0 1) ,脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 CTL 细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) % ,(75 . 6±9.1) % ,抗 CD8+单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) % ,(16 .9± 2 .3) % .结论　 IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对 DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由 CD8+执行 .基因疫苗可能用于预防及治疗 HBV感染     

TS-Fe3O4介导丙型肝炎病毒多表位基因疫苗的研究

目的 研发能诱导有效免疫应答的丙型肝炎病毒(HCV)基因疫苗候选者及探索磁性纳米材料作为基因载体的应用前景.方法 选择5个HCV保守性T/B细胞识别的抗原表位基因,克隆入pcDNA3.1(+),鉴定重组质粒,测定其细胞水平的表达以及在小鼠体内诱导的免疫反应.同时合成壳聚糖(CTS)修饰的Fe3O4磁性纳米微粒(CT...     

重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗的小鼠保护性

目的评价重组表达的轮状病毒(RV)抗原表位疫苗的小鼠体内保护效果及安全性.方法在以FlockHouse virus病毒外壳蛋白为载体的外源抗原表位呈递系统(FHV-RNA2系统)中构建和重组表达RV Vp4蛋白上第223～262位抗原表位(REABC);在原核系统[质粒pET,大肠杆菌BL21(DE3)]中表达的REABC免疫小鼠用细胞培养适应的参照RV Wa(G1PA型)和SA11(G3P2型)经口腔灌胃攻击,对RV攻击后的免疫小鼠和对照小鼠的感染症状、排毒情况、血清抗体中和病毒感染性效价进行测定和分析.结果REABC可诱导免疫小鼠产生较强的抗-Wa和抗-SA11株血清中和抗体和特异的免疫记忆反应,有效保护免疫小鼠对Wa和SA11的攻击(不腹泻),减少病毒在体内复制水平和排毒时间,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.001).结论重组表达RV抗原表位REABC对小鼠具有较好的免疫保护效果和安全性.     

Humoral immune response to HCV core DNA vaccine in mice

DNAvaccine,alsocallednucleicacidvaccine,isarecombinanteukatyoticexpressionplasmidencodingcertainantigenofpathogen.DNAvaccinecanexpressantigenandinducecellularandhumoralimmuneresponsesaftervaccinationbyintramuscularinjectionorplasmid--coatedmicroparticlebombardment.Itshightemperaturestability,lowexpenseofmassproductionandtheabilitytoinducestrongimmuneresponsesevenfortheuseintherapyhavemadeDNAvaccineanexcitingwayfornewvaccinedevelopment['J.InordertofurnishevidenceforHCVDNAvaccinesuitablefo…     

乙肝病毒表面抗原基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答的研究

为观察乙肝病毒 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 基因疫苗免疫小鼠后的细胞及体液免疫应答,将该疫苗定向克隆于质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 巨细胞病毒启动子下游,构建能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 。将此疫苗通过多点肌肉注射免疫 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠后第六周,实验组小鼠均出现抗－ Ｈ Ｂｓ Ｉｇ Ｇ 阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时 Ｔｈ１ 免疫应答相关的细胞因子 Ｉ Ｌ２ 及γ干扰素水平也明显高于对照组,表明本文构建的基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 能诱导 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答。     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

基因芯片法对丙型肝炎病毒RNA的基因型分析

目的：制备丙型肝炎病毒(HCV)基因的分型诊断芯片，检测其对丙型肝炎患者血清HCVRNA基因分型诊断的价值。方法：根据HCV 5′端非编码区末端(5′UTR)和C区设计引物和特异性探针，将设计的20条特异性寡核苷酸探针用核苷酸合成仪合成后，配制成50μmol／ml的点样液，用点样仪点到特殊处理的玻片介质上，制成HCV基因分型诊断芯片。收集HCVRNA阳性的丙型肝炎患者血清30份作为实验组，健康人血清30份作为对照组。用荧光定量PCR仪对两组血清进行HCVRNA定量检测，实验组血清HCVRNA含量均大于5()()copies／ml，对照组血清HCVRNA均为阴性。两组血清进行HCVRNA分离纯化、逆转录反应、巢式PCR扩增后，分别用基因芯片与核酸序列测定法进行双盲HCV基因分型检测。结果：实验组血清基因诊断芯片检测均为阳性；基因分型1b型23例，3a型2例，3b型1例，2a型1例，2b型1例，混合型1b 2a1例，1b 3b型1例；核酸序列测定分型1b型25例，3a型2例，3b型1例，2a型1例，2b型1例；两种方法检测的基因分型符合率为93．3％。对照组血清基因芯片检测均阴性。结论：制备的HVC基因诊断芯片可以用于检测血清HCVRNA，并进行基因诊断分型，准确率较高。     

脂质转染剂增强基因疫苗诱导的免疫应答效力

目的 研究脂质转染剂（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）提高丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗的抗病毒免疫应答效力。方法 人工构建包含ＨＣＶ Ｃ基因片段的的真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡＨＣＶ－Ｃ,在证实期可以在真核细胞中表达之后,将期用脂质转剂包裹,形成ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ－ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ脂质混合物,将该混合物或单纯ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ直接注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠股四头肌,以空载体ｐｃＤＮＡ     

Detection of HBV and HCV Coinfection by TEM with Au Nanoparticle Gene Probes

Gold(Au) nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes were prepared and were used to detect HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection directly by transmission electron microscopy(TEM).PCR identifying HBV and HCV in serum of patients with HBV and HCV coinfection was established.Alkanethiol-modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes through covalent binding of Au-S.HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection was added to the detection system composed of nanoparticle HBV DNA and(or) HCV cDNA gene probes.The results showed that HBV DNA and HCV RNA could be specifically amplified by PCR.The zones of DNA amplification appeared in 431 bp and 323 bp respectively.When HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection were added to the detection system,TEM displayed the nanoparticles self-assembled into large network aggregates.It was concluded that the detection of HBV and HCV coinfection by TEM was convenient and efficient with high specificity and sensitivity.     

甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

基因转染Sp2/0细胞作为检测乙肝病毒基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因转染的Sp2/0细胞作为检测HBV基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的可行性.方法以脂质体介导基因转染,含G418的培养基筛选,获得HBV基因S转染的Sp2/0细胞;构建编码HBV抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗;采用51Cr 4 h释放法体外检测HBV基因疫苗免疫接种小鼠的淋巴细胞杀伤功能.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论以Sp2/0基因转染细胞作为靶细胞检测免疫BALB/c小鼠的淋巴细胞杀伤功能是可行的.