蛋白酶体抑制剂MG132减轻糖尿病大鼠肾小管间质纤维化

目的探讨蛋白酶体抑制剂MG132是否减轻或延缓糖尿病肾病(DN)大鼠肾小管间质纤维化及其可能机制。方法用链脲菌素复制糖尿病大鼠模型(DM),实验分为对照组(NC)及DM组,每组n=10。24周处死大鼠,检测相应生化指标,观察肾组织病理改变;体外培养NRK-52E细胞,予以不同剂量MG132预处理后高糖培养。免疫组化、免疫荧光染色、Western blot检测肾组织和NRK-52E细胞中Smad7、Smurf2、E钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及胶原蛋白(Col-Ⅰ)的表达。结果与NC组相比,DM组大鼠肾组织E-cadherin减少(P0.05)、α-SMA增多(P0.05),FN及Col-Ⅰ蛋白在间质沉积增多(P0.05),而Smad7蛋白减少(P0.05),Smurf2表达增加(P0.05)。MG132抑制了高糖诱导的NRK-52E细胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达(P0.05),并呈量效依赖性,但对Smurf2的蛋白表达无影响;相反,MG132上调了Smad7蛋白及E-cadherin的表达(P0.05)。结论 MG132减缓糖尿病大鼠肾小管间质纤维化。     

血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)表型转化及细胞外基质分泌的影响.方法:体外培养NRK52E细胞,经Ang-(1-7)和AntgⅡ(终浓度均为1×10-6 mol/L)干预24、48、72、96 h后,应用细胞免疫化学法检测E-cadherin,α-SMA的表达;应用ELISA法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原(Col I)和纤维黏连蛋白(FN)的表达;采用实时荧光定量PCR( Real-timePCR)检测细胞中E-cadherin、α-SMA、Col I和FN mRNA表达水平的变化.结果:AngⅡ作用96h后,E-cadherin蛋白及mRNA表达显著减弱(P＜0.05),α-SMA、Col I、FN蛋白及mRNA表达显著增强(P＜0.05);同时加入Ang-(1-7)后,与AngⅡ组比较,E-cadherin蛋白及mRNA的表达增强(P＜0.05),α-SMA、Col I、FN蛋白及mRNA表达减弱(P＜0.05).结论:Ang-(1-7)能够抑制AngⅡ诱导的大鼠肾小管上皮细胞表型转化及细胞外基质的分泌.     

SnoN和Smad2/3信号蛋白与糖尿病大鼠肾小管-间质纤维化的关系

目的 观察核转录共抑制因子SnoN和Smad2/3信号蛋白在糖尿病（DM）大鼠肾组织中的动态表达,并初步探讨它们与糖尿病肾病（DN）肾小管-间质纤维化的关系。方法 尾静脉注射链尿佐菌素（STZ）复制DM大鼠模型,随机分为DM2、4、8、12、16和24周组,每组均设鼠龄匹配的正常对照组(n=6)。免疫组化及Western blotting法检测肾组织SnoN、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）的蛋白表达;RT-PCR检测SnoN的mRNA;生化方法测血糖、血肌酐及24h尿蛋白量。结果 DM4周起肾组织中SnoN蛋白表达明显减少(P < 0.01),DM各组SnoN的mRNA表达无变化;TGF-β1、Smad2/3及FN的蛋白表达随DM病程进展逐渐增多;DM12周始肾小管上皮细胞可见α-SMA阳性表达。结论 SnoN蛋白表达减少与TGF-β1/Smad信号通路共同参与了DN的发生发展过程。     

蛋白酶体抑制剂MG132减轻糖尿病大鼠肾小管间质纤维化简

 目的 探讨蛋白酶体抑制剂MG132是否减轻或延缓糖尿病肾病(DN)大鼠肾小管间质纤维化及其可能机制。方法 用链脲菌素复制糖尿病大鼠模型(DM),实验分为对照组(NC) 及DM组,每组n = 10。24周处死大鼠,检测相应生化指标,观察肾组织病理改变;体外培养NRK-52E细胞,予以不同剂量MG132预处理后高糖培养。免疫组化、免疫荧光染色、Western blot检测肾组织和NRK-52E细胞中Smad7、Smurf2、E钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及胶原蛋白(Col-Ⅰ)的表达。结果 与NC组相比,DM组大鼠肾组织E-cadherin减少(P<0.05)、α-SMA增多(P<0.05),FN及Col-Ⅰ蛋白在间质沉积增多(P<0.05),而Smad7蛋白减少(P<0.05), Smurf2表达增加(P<0.05)。MG132 抑制了高糖诱导的NRK-52E细胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达(P<0.05),并呈量效依赖性,但对Smurf2的蛋白表达无影响;相反,MG132上调了Smad7蛋白及E-cadherin的表达(P<0.05)。结论MG132减缓糖尿病大鼠肾小管间质纤维化。     

PKCα参与高糖调节大鼠肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7的表达

目的观察蛋白激酶Cα(PKCα)对糖尿病(DM)及高糖培养的大鼠肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达的影响。方法将大鼠分为对照组(control)和糖尿病组(DM),每组8只,饲养12周处死动物;将体外培养的原代肾小管上皮细胞,随机分为对照组(control)、高糖组(HG)、高糖+PKCα特异性抑制剂G6976 1μmol/L组(HG+G6976)和高渗组(HM),处理72 h后收集肾小管上皮贴壁细胞,免疫组化及免疫细胞化学观察肾小管上皮细胞BMP-7、PKCα、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和纤维连接蛋白(FN)蛋白表达;Western blot检测BMP-7蛋白的表达;RTPCR法检测BMP-7、PKCα和FN mRNA水平。结果对照组大鼠肾小管上皮细胞BMP-7蛋白及mRNA高表达,DM组或HG组BMP-7的表达明显低于对照组(P0.05),PKCα、AngⅡ和FN的表达较对照组明显增多(P0.05),BMP-7蛋白与PKCα呈显著负相关,HG+G6976组BMP-7蛋白及mRNA表达则较HG组增多(P0.05),AngⅡ和FN则较HG组减少(P0.05)。结论 PKCα可能参与高糖调节大鼠肾小管上皮细胞BMP-7的表达。     

糖尿病大鼠肾组织中miR-21和SnoN表达的变化

目的探讨糖尿病(DM)大鼠肾组织中微小核糖核酸-21(miR-21)和核转录共抑制因子(SnoN)在肾纤维化过程中的表达变化及其可能机制。方法用链脲佐菌素复制DM大鼠模型,并设对照组(NC),每组n=8。10周后处死大鼠,观察肾组织形态变化;免疫组织化学染色、Western blot及RT-q PCR检测miR-21、SnoN、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)的表达。结果与对照组相比,DM组肾组织p-Smad3(Ser423/425)、TGF-β1和α-SMA蛋白表达增加(P0.05),SnoN、E-cadherin蛋白表达减少(P0.05),但SnoN mRNA和miR-21表达明显上调(P0.05),并伴有collagenⅠ、collagenⅢ和FN在间质沉积增多。结论 TGF-β1可能上调miR-21表达,抑制SnoN翻译水平的表达,促进DN的纤维化病变。     

SAHA对糖尿病大鼠肾组织Twist和HDAC1表达的影响

目的:通过观察辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对糖尿病(DM)大鼠肾组织Twist、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及相关上皮-间充质转化和纤维化指标表达的影响,初步探讨SAHA对糖尿病肾病Twist表达变化的可能干预机制。方法:以链脲佐菌素复制DM大鼠模型,实验分为正常对照(NC)组、DM组和SAHA组,每组12只。造模成功8周后,SAHA组用SAHA(25 mg·kg~(-1)·d~(-1))进行灌胃。治疗8周后处死大鼠,HE和Masson染色观察肾组织形态变化;免疫组织化学染色观察肾组织中Twist的表达变化;Western blot法检测肾组织中Twist、HDAC1、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和IV型胶原(Col-Ⅳ)蛋白的表达;real-time PCR检测肾组织中Twist的mRNA表达。结果:DM组的血糖、24 h尿蛋白量和肾脏指数均显著高于NC组;而SAHA组肾脏指数与DM组相比有明显降低(P0.05),24 h尿蛋白量虽有降低,但差异无统计学显著性,而血糖无明显改变。与NC组对比,DM组大鼠肾组织中HDAC1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下调,Twist的mRNA和蛋白表达上调(P0.05);SAHA组大鼠肾组织中的Twist、HDAC1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表达量明显低于DM组(P0.05),且Twist的mRNA的表达比DM组低,E-cadherin蛋白表达较DM组有所上升(P0.05)。相关性结果显示,在糖尿病大鼠肾组织中,Twist与HDAC1蛋白表达呈正相关(P0.05)。结论:SAHA可下调DM大鼠肾组织中Twist的表达,减轻糖尿病肾病大鼠肾纤维化病变,其机制可能与抑制HDAC1和Twist形成进而促进Ecadherin转录有关。     

Notch1在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的表达和意义

目的:探讨Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化(KTECT)中的动态表达及意义.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞株( HK-2)为研究对象,实验分为空白对照组及TGF-β1( 10 ng/mL)诱导组.加入TGF-β1作用后分别于12 h、24h、48 h及72 h在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;用细胞免疫组化染色法检测α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA)、E-钙黏连素(E-cadherin)和Notch1蛋白表达的变化;用RT-PCR法检测α-SMA mRNA、Ecadherin mRNA和Notch1 mRNA表达的变化.结果:与空白对照组相比较,在加入TGF-β1作用后12 h、24h、48 h及72h,TGF-β1诱导组α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加(P＜0 05);Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1作用后的24h、48h、72 h表达逐渐增加(P＜0.05);E-cadherin蛋白及其mRNA表达在24h、48 h、72 h明显减少(P＜0.05);Notch1蛋白及其mRNA的表达与E-cadherin蛋白及其mRNA的表达呈负相关(r蛋白=-0.937;rmRNA=-0.921;假设检验结果(P＜0.05),与α-SMA蛋白及其mRNA的表达呈正相关(r蛋白=0.958;rmRNA=0.944;假设检验结果(P＜0.05).结论:Notch1极有可能参与了TGF-β1诱导的KTECT.     

胰岛素处理促进糖尿病大鼠肾皮质骨形成蛋白和激活蛋白膜结合抑制物(BAMBI)表达并抑制炎症反应

目的研究胰岛素控制糖尿病(DM)大鼠血糖后, DM大鼠肾皮质骨形成蛋白和激活蛋白膜结合抑制物(BAMBI)、含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、凋亡相关的斑点样蛋白2(ASC-2)、胱天蛋白酶1(caspase-1)及炎性介质和相关纤维化指标的表达情况。方法 SD大鼠随机分为正常对照组、 DM组及胰岛素处理组。链脲佐菌素(STZ)复制DM大鼠模型,每组8只, DM成模4周后,胰岛素处理组予以皮下注射胰岛素[8 U/(kg·次)],每天3次,连续注射6周后处死大鼠。免疫组织化学染色检测肾皮质BAMBI、 NLRP3、上皮钙黏素(E-cadherin)的表达, Western blot法检测肾皮质BAMBI、 NLRP3、 ASC-2、 caspase-1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(Col4)蛋白的表达,实时定量PCR检测肾皮质中BAMBI、 NLRP3的mRNA水平, ELISA检测肾皮质中白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-18的水平。采用Spearman秩相关检验对BAMBI和NLRP3蛋白表达进行相关性分析。结果与正常对照组相比, DM组肾皮质NLRP3的mRNA和蛋白水平及ASC-2、 caspase-1的蛋白水平升高,α-SMA、 FN、 Col4蛋白表达也升高,而BAMBI的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白表达降低,胰岛素处理组NLRP3的蛋白和mRNA水平及ASC-2、 caspase-1的蛋白水平低于DM组,α-SMA、 FN、 Col4蛋白表达也低于DM组,而BAMBI的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白表达高于DM组;胰岛素处理组IL-1β、 IL-18的水平较DM组降低,相关性分析显示在DM组以及胰岛素处理组中BAMBI和NLRP3的表达呈负相关。结论胰岛素处理可恢复DM大鼠肾皮质中BAMBI的表达,进而抑制NLRP3炎性体激活,减轻DM大鼠肾脏的炎症反应,阻止或延缓糖尿病肾病的病程进展。     

雷帕霉素对人肾小管上皮-肌成纤维细胞转化的抑制作用

目的 探讨雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)对体外培养的人肾小管上皮细胞发生上皮肌成纤维细胞转化(Epithelial-Myofibroblast Transition,EMT)的作用,以及该作用与上皮细胞中锌指蛋白(Snail)基因水平变化的关系.方法 体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HKC),分为阴性对照组、转化生长因子β-1(TGF-β1)(1 μg/L)阳性对照组和TGF-β1 RAPA组.TGF-β1 RAPA组不同浓度的雷帕霉素(0.1 μg/L,1 μg/L,10 μg/L,100 μg/L)与TGF-β1(1 μg/L)共同作用,各组作用时间均为48 h.用间接免疫荧光双染、RT-PCR、Western Blot方法分别检测细胞平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)表达,同时用RT-PCR方法检测细胞Snail mRNA水平的变化.再选取最大作用浓度的雷帕霉素作用不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h),用RT-PCR、Western Blot方法检测α-SMA表达水平变化.结果 间接免疫荧光双染、RT-PCR、Western Blot方法检测均表明,TGF-β1阳性作用组较阴性对照组HKC细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平显著增强(P＜0.05),而E-cadherin表达则几乎消失,Snail mRNA表达水平显著增强(P＜0.05).与阳性对照组相比,雷帕霉素(10 μg/L,100 μg/L)与TGF-β1共同作用组HKC细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),而E-cadherin表达则有部分恢复,显著高于阳性对照组(P＜0.05),而Snail mRNA表达水平比阳性对照组显著降低(P＜0.05).雷帕霉素以浓度依赖方式抑制TGF-β1诱导的HKC细胞Snail mRNA表达.结论 应用体外培养的肾小管上皮细胞研究表明,雷帕霉素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用.此作用可能与该药诱导的Snail表达下调有关.