实时RT-PCR基因表达相对定量REST(C)软件分析与2(-△△CT)法比较

目的利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株（16HBE）eDNA为模板5倍系列稀释，分别作DNA聚合酶K（POLK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘（anti-BPDE）诱导的16HBE、anti—BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株（H1299）cDNA为模板，进行实时定量RT—PCR。以GAPDH基因作为内参照，进行POLK基因表达相对定量。实验数据分别采用2^（-△△CT）法及REST软件分析。结果5倍系列稀释法制作的标准曲线，呈现较好的线型关系（Rsq 0．997）。POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117．5％和103．5％。采用2^（-△△CT）法计算出的表达比值均比REST软件分析高。结论实时RT-PCR技术结合REST软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。     

实时RT-PCR基因表达相对定量REST~软件分析与2~((-ΔΔCT))法比较

目的利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR。以GAPDH基因作为内参照,进行POLK基因表达相对定量。实验数据分别采用2(-ΔΔCT)法及REST软件分析。结果5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq0.997)。POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%。采用2(-ΔΔCT)法计算出的表达比值均比REST软件分析高。结论实时RT-PCR技术结合REST软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。     

实时定量RT-PCR检测乳腺癌组织Drosha基因表达及其意义

目的通过检测Drosha在乳腺癌组织中的表达情况,探讨其在乳腺癌发生发展中的意义。方法乳腺癌肿瘤组织与正常乳腺组织标本各78例自身配对分成肿瘤组与正常组,提取总RNA,利用SYBR Green1实时定量RT-PCR方法检测Drosha基因mRNA的表达情况。结果在mRNA水平上,Drosha基因在71.80%(56/78)的癌组织中下调,28.20%(22/78)上调。经REST软件分析,其表达下调具有统计学意义(P0.01),Drosha mRNA低表达与TNM分期差异有统计学意义(P0.01),与患者年龄、月经状态、肿瘤大小、淋巴结是否转移、组织学分级、激素受体状态(ER、PR和HER-2)等差异均无统计学意义(P0.05)。结论 Drosha基因在乳腺癌中表达下调,可能与乳腺癌的发生发展有关。     

实时荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌骨转移相关基因表达的研究

目的研究CXCR4、CTGF、MMP-1、IL-11、MST1R、ETV-1 6种基因在鼻咽癌细胞5-8F与骨共培养前后的表达情况,分析这些基因在鼻咽癌骨转移中的作用。方法采用基于SYBR GREENⅠ法的实时荧光定量RT-PCR检测5-8F细胞与骨共培养前后骨转移相关基因的表达情况。结果5-8F细胞与骨共培养后CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1的表达水平较共培养前差异有显著性(P<0.05),均表达上调;MMP-1、IL-11则差异无显著性。结论实时荧光定量RT-PCR能够敏感、特异地检测出鼻咽癌细胞在与骨组织共培养前后的mRNA的表达变化,方法准确可靠,操作方便;CXCR4、CTGF、MST1R、ETV-1有可能成为判断鼻咽癌骨转移的潜在标志物。     

荧光实时定量RT-PCR观察伤寒杆菌鞭毛z66和d/j抗原基因表达方法的建立

目的：构建荧光实时定量RT-PCR测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j编码基因mRNA的方法。方法：根据伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／i编码基因序列,设计引物扩增其读码框架内片段,克隆进pGEM-TEasy质粒。质粒经PCR鉴定后,纯化并定量,作为荧光实时定量PCR的标准品,并制作标准曲线。利用不同渗透压下的鞭毛素基因表达差异,比较三种随机引物(6、8、10核苷酸)与特异性引物的逆转录效果,以确定一种最佳的随机引物用于多基因表达观察。结果：标准曲线有较好的线性(r=0．999),cDNA和标准品的PCR产物溶解曲线峰值一致。用8核苷酸随机引物进行逆转录的敏感度高于6、10核苷酸随机引物,低于特异性引物,但用其观测z66抗原基因和d／j抗原基因在高、低渗时表达变化趋势与用特异性引物测得结果一致。结论：成功构建用8核苷酸随机引物进行逆转录同时测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j基因表达的荧光实时定量RT-PCR方法。     

乙肝相关肝癌组织实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择

目的 实时定量RT-PCR已被广泛应用于基因的表达分析.选择合适的内参基因可以消除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别,从而获得目标基因特异性表达的真正差异.方法 本研究应用实时定量PCR技术,研究了HMBS、C-TBP、HPRT、UBC和18s rRNA 5个内参基因在男性乙肝相关肝癌组织中的表达情况.结果 结果 表明,这5个内参基因表达存在差异.结论 经过geNorm程序统计学分析,确定了HMBS和C-TBP两个看家基因适用于校正目标基因的表达量,为研究男性乙肝相关肝癌组织中目标基因的表达奠定基础.     

实时荧光定量RT-PCR检测肝癌组织中miR-122a及miR-224的表达

目的 运用实时荧光定量RT-PCR方法分析miR-122与miR-224两种miRNAs在原发性肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨以miRNAs为靶点在早期肝癌中的临床诊断意义.方法 采用基于2(-△△ACT)的实时荧光定量RT-PCR法对35例肝癌组织及癌旁组织的miR-122a及miR-224进行了定量分析,结果经由Noahernblot验证.结果 与正常组织相比,在所有的被检肝癌组织中,均发现了miR-122a有不同程度的表达下调(P<0.01),而上述肝癌组织中的miR-224的定量结果显示该miRNA表达显著增加(P<0.001).结论 HCC组织中存在上述两种miRNAs表达水平的改变.实时荧光定量RT-PCR法为早期、准确的在临床上检测肝组织癌变提供了新的思路.     

实时荧光定量RT-PCR在麻疹病毒检测中的应用价值

目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹病毒检测中的应用价值。方法选取2015年10月至2017年3月淮阳县疾病预防控制中心收治的280例疑似麻疹患者,所有患者均接受酶联免疫吸附试验(ELISA)与实时荧光定量RTPCR检测,对比两种检测方法的阳性率。结果 280例疑似麻疹患者中,经实时荧光定量RT-PCR检测咽拭子中麻疹病毒核酸阳性的有166例,阳性率为59.29%;ELISA法检测出血清麻疹Ig M阳性的有139例,阳性率为49.64%。实时荧光定量RT-PCR检测阳性率较ELISA法高,差异有统计学意义(P<0.05)。出疹当天标本的实时荧光定量RT-PCR阳性率为56.52%,ELISA法检测阳性率为17.39%。随着时间的推移,ELISA法检测阳性率不断上升,而实时荧光定量RT-PCR检测在第4天开始逐渐下降。实时荧光定量RT-PCR对出疹2 d内标本检测阳性率较ELISA法高,差异有统计学意义(P<0.05);对于出疹后2 d及2 d以上的标本,两种检测方法阳性率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR在麻疹病毒检测中具有较高应用价值,可早期诊断麻疹病毒,是一种安全、可靠的检测方式。     

TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测SIV/SHIV病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对本室SIV/SHIV病毒RNA定量外标准品RS的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达4.60×101copies/μL,特异性及重复性良好,对同一样品进行16次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.066。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒RNA载量。     

肝癌实时定量RT-PCR中适宜内参基因的选择

目的 探计肝癌(HCC)组织及细胞系实时定量RT-PCR最佳的内参基因选择.方法 通过实时定量RT-PCR,检测HMBS、CTBP1、HPRT1、UBC、B2M、SDHA、RPLI3A、EIF4A1、TUBB、YWHAZ、ACTB、GUSB、GAPDH、18 s rRNA和28 s rRNA 15个内参基因在70例HCC、癌旁肝组织及阿法替尼作用后4个HCC细胞系的表达情况.并使用NormFinder及geNorm软件分析最优化的内参基因.结果 15个内参基因表达存在差异,Cq值在8～29.2间.GAPDH在HCC及癌旁肝组织表达差异有显著性(P＜0.05).结论 NormFinder及geNorm软件均显示HMBS+UBC组合为肝组织的最佳内参,HMBS+ RPLI3A组合为体外肝癌细胞系的最适宜内参.     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒(DV)及DV病毒的RNA拷贝数.方法 利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系.检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.结果 该方法检测灵敏度可达1×103 copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为O.792.结论 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DV RNA载量.     

基因表达连续分析标签数据库的实时定量多聚酶链反应验证

目的 采用实时定量多聚酶链反应(PCR)技术验证不同丰度和匹配度的基因表达序列标签,尝试用该技术补充和完善高通量基因表达谱的结果.方法 根据各基因序列全长设计引物,选择9个单匹配标签,6个多匹配标签,1个美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库更新后无匹配标签和2个无匹配基因进行实时定量PCR验证.结果 挑选的所有基因均得到特异性扩增.基因表达量分析结果显示,基因表达连续分析(SAGE)文库中9个单匹配标签表达趋势和定量结果一致,且具有显著性差别;6个多匹配标签中有3个标签表达趋势和定量结果一致,且具有显著性差别;1个NCBI数据库更新后无匹配标签表达趋势和定量结果相反;2个无匹配基因表达量数据提示两组间没有显著性差别.结论 实时定量PCR技术是验证SAGE等高通量数据的可靠工具之一.SAGE文库标签匹配度可影响数据的可信度.     

PD-L1基因实时荧光定量RT-PCR法的建立及在大鼠肝移植中的应用

目的 建立real-time RT-qPCR(实时荧光定量RT-PCR)检测大鼠PD-L1的方法,应用该方法检测大鼠移植肝中PD-L1 mRNA的水平.方法 两袖套法复制大鼠肝移植耐受组(BN→BN)及排斥组( LEW→BN)模型,术后7d处死受体,检测肝功能ALT和AST水平,HE染色病理分析排斥程度,Trizol法提取移植肝总RNA并反转录为cDNA;选β-actin作为内参,复制SYBR Green I real-time RT-qPCR检测法.利用该方法检测移植肝中PD-L1和β-actin的初始模板量,PD-L1/β-actin计算PD-L1 mRNA的相对表达量.结果 异基因LEW→BN组出现急性排斥反应,ALT、AST排斥组均高于耐受组(均P＜0.05).RAI评分排斥组高于耐受组(均P ＜0.05).PD-L1扩增效率为98.8％,相关系数为0.996;溶解曲线为特异单峰;变异系数小于2.0％;移植肝中PD-L1 mRNA相对表达为耐受组[(0.95±0.10)×10-2]高于排斥组[(0.81±0.09)×10-2],差异有统计学意义(t=2.62,P=0.026).结论 成功建立了大鼠源PD-L1的real-time RT-qPCR检测方法,耐受组PD-L1的高表达提示其可能有利于大鼠移植肝的存活,为研究肝移植免疫耐受奠定了理论基础.     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的：比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,χ2=8.1, P<0.005。结论通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。     

结直肠癌组织定量RT-PCR分析中内参基因的选择

目的:筛选适用于结直肠癌组织样本的内源性参照基因?方法:以10例结直肠癌患者组织总RNA为研究材料,采用实时定量RT-PCR检测GAPDH?ACTINB?UBC?HRPT1和18S rRNA这5个候选内参基因的表达量,应用geNorm和NormFinder两种软件分析选择最佳内参基因?结果:geNorm软件发现GAPDH与ACTINB的M值相对最小,为最佳内参基因组合,18S rRNA的M值最大,稳定度最低;而NormFinder软件分析认为GAPDH表达稳定性最佳,UBC次之?结论:适用于结直肠癌组织样本RT-PCR实验的内参基因为GAPDH,最佳组合为GAPDH与ACTINB,而18S rRNA及HRPT1不是合适的内参基因?     

实时荧光定量RT-PCR分析非小细胞肺癌SATB1 的表达和临床病理意义

目的 检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义. 方法 用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法 检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中SATB1 mRNA的表达,分析SATB1基因表达与临床病理参数的相关性.结果 癌组织中SATB1 mRNA表达量为正常组织13倍,两者差异显著(P<0.001),其中有、无转移组分别为正常组织23.63倍和5.57倍.结论 SATB1 mRNA的表达水平可能与非小细胞肺癌发生发展及淋巴转移有关,有望成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标.     

定量RT-PCR法检测冠心病患者外周血15-脂氧合酶基因表达水平的研究

目的建立检测15-脂氧合酶(15-Lipoxygenase,15-LOX)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR方法,测定冠心病患者外周血单核细胞中15-LOX的基因表达水平,探讨15-LOX基因表达水平与冠状动脉粥样硬化发生、发展的关系。方法构建重组质粒pMD18-T-15-LOX作为定量模板,建立以Taqman探针技术为基础的Real-ti me定量RT-PCR方法,测定了60例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者和40例健康对照组白细胞中15-LOX mRNA的含量。结果15-LOX mRNA在60例患者单核细胞中的表达范围为4.23×104～2.67×107copy/mL;40例健康对照的表达范围为6.15×103～5.25×106copy/mL,冠心病组15-LOXmRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组〔(7.43±3.81)×105vs(4.79±1.76)×104;P<0.05〕。结论成功建立了15-LOX基因表达含量的荧光定量检测方法,检测发现冠状动脉粥样硬化性心脏病患者单核细胞中15-脂氧合酶mRNA的含量显著高于健康对照组,单核细胞中的15-LOX表达量与动脉粥样硬化的发生、发展存在一定的相关性。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

目的 建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法.方法 依据HSV2 ICP4基因序列设计引物.PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品.根据测序结果设计荧光定最PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析.结果 测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变.标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10.可靠性测定结果:107-101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%.Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.回归系数为0.998.结论 成功建立了HSV2 ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2 ICP4基因的定量分析.