人I型谷丙氨酸氨基转移酶的原核表达及抗血清的制备

目的：构建人谷丙氨酸氨基转移酶（ALT1）的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫家兔,制备ALT1抗血清．方法：从HepG2细胞中提取总RNA,RT—PCR扩增alt1基因,并将其克隆人pMD19-T载体中测序,将测序正确的目的基因克隆至PET-32a（＋）表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、WesternBlot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA,WesternBlot进行检测．结果：测序证实克隆的基因序列与GenBank中的ALT1序列相符;SDS—PAGE,Westernblot结果证实获得Mr为75×10^3的ALT1融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni^2＋亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1：100000,WesternBlot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合．结论：获得了ALT1重组蛋白及特异性多克隆抗体．     

人心脏发育相关基因ZNF382的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化ZNF382融合蛋白及制备兔多克隆抗体.方法 通过PCR扩增ZNF382编码区,将其克隆到pRSET C载体中,重组载体酶切鉴定,测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,原核表达产物经鉴定、纯化后,免疫新西兰大白兔.通过ELISA和Western blot检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了pRSET C-ZNF382原核表达重组质粒,His6-ZNF382融合蛋白被强烈诱导表达,以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为 64×103,纯化后免疫产生的多克隆抗体效价约为1∶10 000,与ZNF382原核表达蛋白特异性结合.结论 获得了大量高效价、高特异性的兔抗人ZNF382多克隆抗体.     

人3型腺病毒纤突的原核表达及其免疫原性分析

目的克隆表达人3型腺病毒(HAdV-3)的纤毛蛋白纤突片段(knob),分析其免疫原性,为腺病毒临床诊断试剂及新型疫苗的研发奠定基础。方法 PCR扩增knob基因片段,克隆到表达载体pGEX-4T-3中进行诱导表达,SDSPAGE电泳分析表达产物,包涵体溶解复性后亲和层析纯化融合蛋白,Western blot鉴定,纯化的蛋白免疫小鼠制备抗血清,间接ELISA法检测小鼠血清的效价,Western blot鉴定抗血清特异性。结果成功构建了重组原核表达质粒pGEX-Ad3 knob,其在大肠杆菌中高效表达并纯化重组knob融合蛋白,融合蛋白免疫小鼠抗血清效价高达10~7,Western Blot证实此抗血清可识别人3型腺病毒纤维蛋白。结论成功获得了重组HAdV-3 knob蛋白,其具有强免疫原性,可以作为研发人3型腺病毒入侵机制研究、诊断试剂及疫苗研发的原料。     

大鼠新基因PMP22CD的克隆以及多克隆抗体的制备

目的:通过PCR克隆PMP22CD基因,构建原核表达载体PET-32a(+)/PMP22CD,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定基础.方法:通过PCR的方法克隆PMP22CD基因,选择抗原性较强的C-端,构建原核表达载体PET32a(+)/PMP22CD,在大肠杆菌BL21(DE3 Lysis)中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白以包涵体的形式存在,应用电洗脱的方式获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,获得抗血清,通过琼脂糖双扩和Western Blot检测抗血清效价和特异性.结果:经测序鉴定成功克隆PMP22CD基因,并构建PET-32a(+)/PMP22CD重组质粒,表达融合蛋白,免疫新西兰大白兔,获得PMP22CD多克隆抗体.结论:得到了纯化的PET-32a(+)/PMP22CD融合蛋白,获得了效价高、特异性强的抗体.     

肺炎链球菌丝氨酸-苏氨酸激酶基因的原核表达及免疫血清的制备

目的制备抗肺炎链球菌(S.pn)丝氨酸-苏氨酸激酶(STKP)基因的特定区域的免疫血清,为疫苗研究奠定基础。方法 PCR扩增S.pn STKP蛋白C末端314个氨基酸区域的基因,将其克隆入pMD19-T载体,将鉴定正确的STKP基因从pMD19-T载体亚克隆至PET-32a(+)原核表达载体进行诱导表达;获得的可溶性蛋白经Ni2+柱纯化及Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗STKP血清,间接ELISA鉴定抗体效价,Western blot鉴定免疫血清特异性。结果成功将STKP基因特定序列克隆入PET-32a(+)原核表达载体并诱导表达,形式以可溶性表达为主,经Ni2+柱层析法纯化STKP,纯度达92%,免疫家兔制备出STKP免疫血清,间接ELISA检测抗体效价为1∶100 000,Western blot证实免疫血清能与目的蛋白特异结合。结论获得STKP重组蛋白及免疫血清,重组表达产物具有免疫原性,为S.pn多价联合蛋白疫苗研制奠定了基础。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

HCMV pp65在原核细胞中的表达、纯化及其抗血清的制备

目的 采用原核表达系统获得HCMV pp65目的 蛋白,免疫家兔制备该蛋白特异性抗血清.方法构建表达GST-HCMV pp65融合蛋白的质粒,在大肠杆菌中诱导表达,经GST亲和层析纯化后的pp65蛋白免疫家兔,获得兔多克隆抗血清.采用ELISA、SDS-PAGE电泳及Western blot检测纯化后的蛋白,并以间接免疫荧光染色法检测鉴定该蛋白的抗原性.结果成功构建PGEX-5X-pp65重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得可溶性的融合蛋白;GST亲和层析纯化后的蛋白免疫家兔获得特异性抗血清.结论 在原核细胞中成功获得了融合蛋白pp65,免疫家兔后获得具有高度特异性抗血清.为进一步揭示该蛋白的功能及作用机制奠定了重要基础.     

人YB-1蛋白的高效原核表达、纯化及其多抗的制备

目的 构建YB-1原核表达系统,诱导表达后纯化YB-1融合蛋白并制备其多抗.方法 采用RT-PCR扩增YB-1编码序列,将该序列克隆至载体pET-32a(+);转化BL21(DE3),确定最佳表达条件;采用亲和层析与超滤纯化目的 蛋白,经Western blot鉴定后免疫家兔,制备其抗体.结果 成功扩增YB-1编码序列并构建了其表达载体;SDS-PAGE结果显示,表达条件经优化后(28 ℃, 5 h, 0.5 mmol/L IPTG),YB-1融合蛋白在BL21中得到高效可溶性表达;Western blot结果证实,表达产物经纯化后获得了纯度较高的YB-1融合蛋白,将该蛋白免疫家兔后获得了效价与特异性较高的抗体.结论 成功建立了YB-1蛋白的原核表达系统及蛋白纯化方法,并制备了其抗体.     

胰十二指肠切除术后住院时间影响因素分析-回顾性研究

Background. Postoperative hospital stay after pancreaticoduodenectomy (PD) was relatively longer than other gastrointestinal operations, The aim of current study was to investigate the risk factors of postoperative hospital stay after PD. Methods. Patients who were performed PD in Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences (CHCAMS) between December 2008 and November 2012 were selected for the retrospective study. The clinical and pathological data was collected and analyzed. The primary outcome was postoperative hospital stay. Normal discharge or recovery was defined as postoperative hospital stay no more than 10 days, otherwise it was defined as delayed discharge or recovery (including hospital death). Results. Finally, 152 patients were enrolled in present study. Postoperative hospital stay was 19.7±7.7 (7-57 d). 67 of 152 patients were normal discharge, and 85 of 152 patients were delayed discharge. The overall morbidity of complications was 62.5% (95/152), and the mortality rate was 3.29% (5/152). Multiple factors analysis showed that complication morbidity (adjusted OR=10.40, 95%CI=3.58-30.22), age (adjusted OR=4.09, 95%CI=1.16-14.39), BMI (body mass index) (adjusted OR=4.40, 95%CI=1.19-16.23), surgical procedure (adjusted OR=26.14, 95%CI=4.94-153.19), blood transfusion (adjusted OR=7.68, 95%CI=2.09-28.27) and fluid input (adjusted OR=3.47, 95%CI=1.24-11.57) were significantly associated with delayed discharge. Conclusions. Postoperative complications affects the postoperative hospital discharge. Furthermore, age, BMI, transfused red blood, surgical procedure and input might prolong LOS (length of hospital stay). Studies with more patients were needed in future.     

原子吸收火焰法测定合力康粉剂中钾、钠、钙、镁、锌、铁的含量

目的：采用原子吸收火焰法测定合力康粉剂中钾、钠、钙、镁、锌、铁的含量。方法：用盐酸-硝酸-水(9：1．5：25)混酸湿法水浴加热消化处理样品，硝酸锶作镁离子释放剂，乙炔-空气火焰原子吸收法。结果：钾、钠、钙镁、锌、铁加样回收率与RSD(n=5)分剐为98．3％、0．8％；100．8％、3．2％；101．8％、1．3％；102．5％、2．1％；101．2％、2．8％；97．4％、2．4％。特征浓度分别为(产生0．0044吸收所需要的浓度，μg/m1)0．02、0．01、0．07、0．003、0．0l、0．06。结论：该方法简便、快速、结果准确，适用于合力康粉剂粉剂中钾、钠、钙、镁、锌、铁的含量测定。     

电针刺激耻骨上四穴治疗女性压力性尿失禁临床疗效观察

目的 观察电针耻骨上四穴对女性压力性尿失禁患者的影响。方法 选取2020年12月-2022年11月期间经金华市中医医院临床确诊为压力性尿失禁的女性患者40例,采用数字随机法分为治疗组和对照组,对照组选用盆底肌锻炼治疗,隔日治疗1次,共治疗15次;治疗组在盆底肌锻炼治疗的基础上,采用电针刺激耻骨上四穴(气冲、冲门、横骨、曲骨等四穴),隔日治疗1次,共治疗15次;。分别记录治疗前、治疗结束后3周ICIQ-SF评分、72h尿失禁次数并进行疗效评价,分别于治疗前、治疗后第3周进行经会阴超声测量BND、PUVA、URA。结果 经治疗后第3周,2组间总有效率比较,治疗组明显优于对照组(p<0.01),治疗组ICIQ-SF评分、72h尿失禁次数均低于对照组(均p<0.05),且经会阴超声测量的BND、PUVA、URA均低于对照组(均p<0.05)。结论 电针治疗女性压力性尿失禁可有效降低患者BND、PUVA、URA,改善盆底结构,从而减少患者尿失禁的次数及降低ICIQ-SF评分。     

矮身材儿童血铅镉锌钙铁铜镁水平分析

目的探讨血铅、镉、锌、钙、铁、铜、镁水平对儿童生长发育的影响。方法通过采用钨舟原子吸收光谱仪测定我院儿保门诊53例矮身材儿童（矮身材组）及53例正常儿童（对照组）末梢静脉血中铅、镉、锌、钙、铁、铜、镁水平,并对其与儿童生长发育关系进行分析。结果矮身材儿童血铅明显高于正常对照组,锌、钙、铁明显低于正常对照组（P〈0．05）。而血镉、铜、镁与对照组则无明显差异。矮身材组血铅男童明显高于女童（P〈0．05）。结论矮身材儿童的生长发育迟缓可能与高血铅,低血锌、钙、铁密切相关。儿童铅中毒防治和合理的膳食结构是降低儿童矮身材发生率的重要措施。     

检测阴性设计：基本原理、方法、衍生设计、优劣势及应用

检测阴性设计是一种简便、快速且有效的研究方法,被广泛应用于疫苗上市后效果评价,有助于国内外基层医疗卫生机构及其他卫生机构评估疫苗上市后效果及其他干预措施效果,其应用前景广阔。随着实时检测阴性设计、整群随机检测阴性设计等新型衍生设计类型的出现,该研究设计被逐步应用于疾病危险因素探索、干预措施效果评估等。然而目前国内相关研究报道较为缺乏。本研究介绍了检测阴性设计的定义、基本原理、方法、设计实施要点,以及实时检测阴性设计、整群随机检测阴性设计等最新衍生设计类型、优势、局限性,在疫苗上市后效果评价以及其他干预措施效果评估等方面的应用,为国内学者开展相关研究提供理论与实践依据。