丙型肝炎病毒NS3区优势表位基因的克隆和高效表达研究

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的Ｃ３３ｃ的Ｃ３３ｃ基因编码蛋白是ＨＣＶ抗体检测中所需的重要抗原。应用打点杂交法得到了来源于３例病人的８个Ｃ３３ｃ的克隆，并从中挑选出能在大肠杆菌中高效表达的克隆──ｐＫＨ２６。该重组质粒中的插入片段与ＨＣＶ－Ｊ的核苷酸同源性为９２．６％，所编码氨基酸的同源性为９５．９％，属于中国主要的ＨＣＶ流行株，它可通过温度变化这种简单，方便，经济的方式进行诱导表达，得到以天然蛋白形式存     

丙型肝炎病毒NS5A区插入序列因子的初步研究

研究丙型肝炎病毒ＮＳ５Ａ区插入序列（ＩＳ） 因子及其来源。以ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＨＣＶ ＮＳ５Ａ区第６８７１至７１２１ 区段， 对扩增产物进行核苷酸测序并与ＨＣＶ－Ｊ株相应区段序列相比较。结果发现ＨＣＶ ＮＳ５Ａ 区插入一个４８ ｂｐ 的ＩＳ因子， 将ＩＳ因子与ＨＣＶ－Ｊ株全核苷酸序列进行同源性对照， 发现该片段来源于ＨＣＶ Ｅ１区。该研究首次报告了ＨＣＶ ＮＳ５Ａ区有来自Ｅ１区的漂移基因片段， 并对其临床和生物学意义进行了初步讨论。     

生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表达

为了建立丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的双抗原夹心ELISA检测方法．克隆表达带有生物素标签的Hcv多种抗原优势表位融合蛋白，选取HCV各抗原如Core，NS3，NS4，NS5和E的优势抗原表位片段编码序列．克隆重组为融合基因，插入Pinpoint^TM Xa-1 T载体中诱导表达，并用Western blot进行抗原性及标签生物素活性鉴定；表达抗原经Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin系统亲和层析纯化后包被酶联板，用抗HCV单片段抗体阳性血清对表达融合蛋白各区的抗原性作间接ELISA法鉴定。结果显示：成功构建了带有生物素标签的HCV多抗原表位融合基因表达载体，该载体可在JM109(DE3)中可溶性表达目的蛋白，表达产物携带生物素标签，融合的各片段区均具有良好的抗原性。结论：所构建融合抗原可可溶性表达，可以用作双抗原夹心ELISA的酶标抗原．所含生物素标签也可用作酶联检测的生物素一亲和素信号放大系统。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白对QSG7701细胞survivin的影响

目的观察丙型肝炎病毒NS3蛋白对QSG7701细胞survivin的影响及其与细胞凋亡的关系,以探讨HCVNS3蛋白是否通过调节survivin的表达来参与对细胞凋亡的调控,进而参与HCV相关性肝癌的发生。方法采用Western blot、免疫细胞化学检测血清饥饿前后细胞survivin蛋白表达的变化,采用TUNEL法检测血清饥饿前后细胞凋亡的变化。结果HCVNS3蛋白促进QSG7701细胞survivin的表达,血清饥饿诱导凋亡后,survivin表达降低,HCV NS3蛋白亦表现出促进survivin表达的作用,效果呈浓度依赖性和时间依赖性。经血清饥饿诱导凋亡后,HCV NS3蛋白抑制凋亡。结论HCV NS3蛋白可能通过促进QSG7701细胞survivin的表达从而抑制细胞凋亡,对HCV相关性肝癌的形成有一定作用。     

基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型

目的：建立基于丙型肝炎病毒(HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法，对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法：用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患血清标本的HCV RNA水平进行定量分析。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和套式-PCR扩增HCV RNA阳性的41份标本的部分HCV NSSB区基因，PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载25份不同基因型的HCV原型序列，用NSSB区222bp的基因片段构建系统进化树，对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果：基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析，可成功地对本组41份标本进行基因分型。分型结果显示，1b型占85．4％(35／41)，2a型占12．20％(5／41)，3a型占2．44％(1／41)。结论：基于HCVNSSB区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以1b型为主。     

丙型肝炎病毒NS5a区血清型特异性多肽的选择及应用

目的:从HCV非结构5a区(NS5a)选出基因型特异性多肽,并应用酶免疫法(EIA)进行HCV血清分型。方法:根据HCV NS5a高免疫源区(2182～2343)的氨基酸序列,设计并合成305个特异性多肽,应用已知基因1～6型的抗-HCV阳性血清,通过EIA法检测每个多肽的抗原性,并用基因型特异性多肽进行血清分型,同时将其与序列分析法基因分型结果进行比较。结果:不同基因型间NS5a区氨基酸的同源性较低,相同基因型不同区段氨基酸的同源性也很低。对305个特异性多肽抗原性检测结果表明,主要线性抗原区位于氨基酸残基R3、R7和R9区。18个来自保守区的多肽可与不同基因型抗-HCV阳性血清反应;12个多肽具基因型特异性。血清基因分型结果与基因分型的结果高度一致。结论:HCV NS5a高免疫源区存在主要的线性抗原;来自高度保守区的多肽抗原无基因型特异性,可用于HCV抗体检测;基因型特异性多肽可用于HCV基因分型,特别适用于HCV RNA阴性患者。     

HCV-NS3抗原基因的克隆表达及活性测定

[目的]研制新的更符合我国HCV感染株的NS3抗原，以进一步提高HCV免疫检试剂的灵敏度。[方法]对HCV／NS3（1192-1457aa）片段序列进行在线Blast分析，根据共有序列（consensus）设计并合成引物。以Trizol法从病人血清中提取总RNA，经反转录PCR扩增获得NS3相应目的基闪，插入载体、经测序正确后，克隆表达，表达产物经纯化后用间接ELISA法测定其反应活性。[结果]从病人血清中获得了NS3部分基闪片段，测序证明所获得的序列和我们以前的la型NS3序列有18个不同的氨基酸残基。重组新NS3抗原经活性测定，反应灵敏度有较大提高。[结论]新获得的HCV-NS3可用于试剂盒抗原，以提高对我国HCV感染病人检测的灵敏度。     

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染的实验室检查

一、乙型肝炎病毒(HBV)感染的检测 乙型肝炎病毒感染有多种血清学标志物已为临床实验室所熟悉.     

丙型肝炎病毒5'utr分型和C区基因分型结果的比较

目的比较丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）不同基因分型方法的一致性。方法采用5’非编码区（NCR）型特异性引物分型法和核心区型特异性引物分型法分别对95例和其中的31例HCV RNA阳性患者的血清样本进行基因分型,分析不同分型方法的灵敏度和稳定性异同。结果两种分型方法的一致性达到93．5％,对于混合感染的发现能力C区分型较强．稳定性无差异。结论C区分型方法更加精确。     

丙型肝炎病毒优势表位抗原不同嵌合表达蛋白的血液反应性研究

目的：采用含HCV不同优势表位抗原进行连接表达，对20份血清进行对比检测，探讨血清反应性。方法：构建原核融合表达载体pBVIL-1，精选出HCV主要表位抗原插入表达载体在E.coli中表达，纯化后的融合抗原包被酶联板，用ELISA方法进行测定。结果：不同抗原组合连接（HCV NS4－Core、NS4-Core-NS3、NS4-Core-NS5AB-NS3)对血清的反应性不同。结论：含有多个抗原表位的嵌合抗原，能提高检测的灵敏度。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１），经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实这些融合蛋白具有ＨＣＶ的特异抗原活性，提示这些融合蛋白可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机理的研究。     

广州地区无偿献血人群HCVE1和NS5B基因的测序和分型

目的了解广州地区无偿献血人群丙型肝炎病毒部分基因的核苷酸序列和基因型分布。方法收集广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本201份,采用荧光定量PCR(Q-PCR)的方法对其进行核酸检测,阳性标本同时作HCVE1和NS5B基因扩增;核苷酸序列测定后运用DNASTAR,B ioEd it,M ega4.0等软件作序列分析和基因分型。结果 201份抗-HCV阳性标本的HCV RNA阳性率为54.23%(109/201),其中男性的HCV RNA阳性率为63.19%(91/144)、女性为31.58%(18/57)(P<0.05)。109份HCV RNA阳性的标本全部扩增出E1和NS5B基因,基因分型显示其HCV基因型比例依次为1b(46.79%)、6 a(33.03%)、3 a(10.09%)、2 a(5.50%)、3b(3.67%)、1 a(0.92%)。结论广州地区抗-HCV阳性的无偿献血人群HCV RNA阳性率男性高于女性,HCV毒株以1b和6 a亚型最多见。     

HCV NS3诱导小鼠特异性T细胞反应的抗原多肽序列筛选

目的 筛选HCV NS3的小鼠T细胞表位多肽序列.方法 BALB/c小鼠用HCV NS3加po-ly （I∶C）或CpG ODN及Montanide ISA720佐剂免疫后,分离其脾淋巴细胞,以覆盖HCV NS3全基因的合成重叠多肽组成的不同多肽库进行刺激,以ELISPOT及流式细胞术检测分泌干扰素γ（IFN-γ）的细胞数及CD8＋/IFN-γ＋细胞或CD4 ＋/IFN-γ＋细胞百分比,确定抗原性最强的多肽库,找出HCV NS3的小鼠T细胞表位多肽.结果 通过ELISPOT及流式细胞术检测,能够刺激淋巴细胞分泌IFN-γ最多及CD8 ＋/IFN-γ＋细胞或CD4＋/IFN-γ＋细胞百分比最高的多肽被选出作为阳性多肽,其中的一个多肽经进一步的ELISPOT及流式细胞术检测确认,其序列为GGCSGGAYDⅢCDECHS.结论 HCV NS3小鼠T细胞表位序列的确定为HCV疫苗的研究打下了基础.     

丙肝病毒与乙肝病毒重叠感染几率观察

目的通过对查体人群及已感染丙肝病毒(HCV)病人的乙肝病毒(HBV)感染率进行比较分析,观察HCV重叠感染HBV的几率情况。方法利用酶联免疫吸附试验,对两组分别检测HBV感染情况。结果查体人群的HBV感染率为9.76%,HCV感染病人的HBV感染率为32.7%,两组间差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论 HCV感染人群组中重叠感染HBV的几率较高,对抗-HCV阳性患者应注意警惕重叠感染。     

标准物质在乙型和丙型肝炎病毒核酸检测标准化中的重要性

病毒核酸是HBV和HCV感染诊断和治疗监测的重要标志物，病毒核酸标准物质是不同实验室间检测结果可比性、试剂溯源性、测量程序的评价和质量控制的物质基础。无生物传染危险性且稳定的标准物质的研究是HBV和HCV核酸检测标准物质的发展方向。     

纳米金比色芯片同步目视化检测HBV和HCV

目的 建立一种简单、快速的比色芯片可同时目视化检测HBVDNA和HCVRNA。方法 利用多重PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中提取的HBVDNA和HCVcDNA。制备Au纳米颗粒基因探针，检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针，用斑点杂交法检测HBVDNA、HCVcDNA的多重PCR产物，加入银离子（Ag^＋）-对苯二酚液染色观察结果。结果 多重PCR可同时扩增HBVDNA和HCVcDNA，出现预期的431bp和323bp特异性条带。纳米金比色芯片可以同步目视化检出乙型、丙型肝炎合并感染患者血清中HBVDNA和HCVRNA的PCR产物。结论 目视化HBV、HCV纳米金比色芯片诊断方法操作简单、特异性好、成本低廉、结果 判定指标客观，此类基因芯片在病毒基因检测领域将会有广泛用途。     

丙型肝炎病毒基因分型芯片的研制和临床应用

目的　研制丙型肝炎病毒 (HCV)基因分型的寡核苷酸探针芯片 ,并用此方法对 76例HCVRNA阳性的肝炎患者进行检测。方法　根据HCV 5′ 非编码区和核心抗原区序列设计聚合酶链反应 (PCR)引物和寡核苷酸探针 ,探针经一定修饰后固定到尼龙膜上 ,即成为HCV基因芯片。采用PCR参入法标记地高辛分子 ,其中 6份标本PCR产物同时进行测序分析。结果　此芯片可分析HCV 11个基因型的 15种亚型。 76例HCV肝炎患者芯片杂交结果均阳性 ,而 2 0名健康对照血清均阴性。 76例患者阳性标本的分型结果 :1b型 6 4例 ,2a型 11例 ,3a型 1例 ,未见混合型感染。 6份标本的序列分析表明 ,芯片杂交和测序的分型结果完全一致。结论　此芯片可初步用于检测血清HCVRNA ,并对HCV基因 (亚 )型进行准确分析     

型别特异性丙型肝炎病毒嵌合抗原在血清分型中的应用

目的克隆表达型别特异性丙型肝炎病毒HCV 1b、2a嵌合抗原,并用于HCV血清分型检测。方法分别对HCV 1b、2a的C区和NS4区进行表位预测,选取优势表位序列连接后,于PGEX-4T-2载体中克隆表达嵌合的HCV 1b、2a抗原,应用竞争抑制酶联法对44份HCV 1b和18份2a血清进行血清分型检测。结果 62例血清样品中50例能分型,其中1b型34例,2a型16例,其分型率为80.6%(50/62),与基因型的符合率为90.0%(45/50)。结论丙型肝炎病毒HCV 1b、2a嵌合抗原用于HCV的血清分型检测,具有较高的准确率和分型率,可用于HCV血清分型检测。