可注射性纤维蛋白胶对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察纤维蛋白胶（Fs）对体外培养的兔骨髓基质细胞（MSCs）增殖和分化的影响。方法实验分两组：含有Fs的实验组和不加任何材料的对照组。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对两组MSC的增殖活性、贴壁率、碱性磷酸酶（ALP）表达、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行研究。结果①实验组MSCs的增殖活性和贴壁率明显高于对照组（P〈0．05）。②实验组MSCs的ALP活性显著高于对照组（P〈0．05）。实验组第7天时的ALP活性显著高于第5天时本组的ALP活性（P〈0．05）。实验组MSCs的Ⅰ型胶原表达水平显著高于对照组（P〈0．05）。③扫描电镜观察：实验组MSCs与材料融合生长。透射电镜观察：实验组的MSCs细胞增殖活性好,向成骨细胞方向分化水平高,而对照组MSCs的细胞增殖活性相对较低,分化相对较差。结论FS生物相容性好,对MSCs增殖和向成骨细胞方向的分化均有明显促进作用,可作为骨组织工程材料的注射型载体进行进一步研究。     

纤维蛋白胶复合骨形成蛋白的注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察以纤维蛋白胶（fibrin sealant，FS）为载体复合骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）增殖和分化的影响，为其临床应用提供实验依据。方法取3日龄新西兰兔骨髓进行培养传代，采用第3代细胞进行研究。实验分为3组，实验组：以含1μg／ml rhBMP-2注射型FS培养细胞；FS对照组：以单纯FS培养细胞；空白对照组：不作任何处理。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对各组兔MSCs的增殖、贴壁率、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性及染色、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行观察。结果各组细胞促增殖作用由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；对细胞贴壁率的影响总体由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。各组ALP活性由强到弱依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；各组细胞的Ⅰ型胶原表达水平由高到低依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，差异均有统计学意义（P〈0.05）。扫描电镜观察，材料表面粗糙，有微孔存在，FS对照组、实验组细胞与材料融合生长。透射电镜观察：实验组细胞向成骨细胞分化程度高，但细胞增殖活性较FS对照组稍差；FS对照组细胞向成骨细胞分化的程度较实验组低，细胞增殖活性较好；空白对照组的细胞增殖活性较差，胞外基质少。结论以FS为载体复合BMP的注射型骨修复材料可显著提高MSCs向成骨细胞方向的分化水平，但对MSCs促增殖作用不明显。     

兔骨髓基质细胞体外成骨分化鉴定及与煅烧骨复合培养的实验研究

目的研究兔骨髓基质细胞体外向成骨细胞分化的生物学特性及其与牛煅烧骨体外复合培养的生物相容性.方法将体外培养1周的兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化,于1、2、4周时提取RNA,采用RT-PCR技术检测ALP和I型胶原mRNA表达,并对培养2周的细胞行VonKossa染色观察钙结节形成;另制备细胞-煅烧骨复合物,继续培养1、7、14 d后取出,扫描电镜观察及X射线衍射仪检测.结果体外诱导培养2、4周后,兔骨髓基质细胞成功表达ALT和I型胶原,VonKossa染色可见钙结节形成.扫描电镜及X射线衍射分析证实细胞在煅烧骨表面大量贴附成活,14 d后细胞铺满支架表面,合成并分泌胶原纤维及钙盐.结论兔骨髓基质细胞体外可成功向成骨细胞诱导分化,成骨特性表达佳;与牛煅烧骨体外复合培养显示良好的生物相容性.     

煅烧骨与水凝胶复合对骨髓基质细胞贴附和生长的影响

目的：观察煅烧骨（CBB）与聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯三聚体（PEO－PPO－PEO）聚合物水凝胶（HG）复合对骨髓基质细胞（MSC）的贴附，增殖及分化的影响，探讨组织工程骨构建的最佳方法。方法：CBB、HG、MSC按不同方式和顺序复合，形成三种复合物CBB／HG／MSC和A组、HG／MSC／CBB为B组、CBB／MSC／HG为C组，CBB／MSC作为对照进行体外培养。5、10天取材，扫描电镜观察细胞形态以及与材料的贴附情况，细胞计数观察其增殖情况，组织化学方法检测MSC的碱性磷酸酶（ALP）活性及免疫组织化学方法检测其Ⅰ型胶原基因表达情况，结果：扫描电镜见A、C组与对照组细胞完全伸展，但A组细胞数量明显增多，重叠生长，细胞外基质分泌增加，优于C组和对照组，而B组细胞大多数圆形，轻微伸展，无细胞外基质分泌。A组与C组的ALP活性无差异（P＞0．05），但显著高于B组和对照组（P＜0．05＝。5天时四组细胞Ⅰ型胶原合成情况无明显差异，但10天时B组细胞的Ⅰ型胶原平均灰度值明显高于其它三组（P＜0．01）。结论：CBB、HG与细胞不同的复合对MSC的贴附，增殖，分化均有影响，CBB／HG／MSC顺序复合较好。     

珍珠层人工骨促进成骨细胞的体外成骨能力

目的：研究珍珠层人工骨对人成骨细胞体外成骨能力的影响。方法：将珍珠层人工骨、聚乳酸（对照组）与人成骨细胞共同培养，观察细胞形态、细胞活性、碱性磷酸酶（ALP）活性和基质钙化情况。结果：实验组在细胞形态、细胞活性等指标与对照组相比差异无显著性；实验组在培养7d及14d后ALP阳性细胞数多于对照组；培养21d后可观察到骨结节，对照组没有骨结节产生。结论：珍珠层人工骨可促进成骨细胞的体外成骨能力。     

可注射型骨修复材料对兔MSC增殖及分化的影响

目的：观察以纤维蛋白胶为载体的骨修复材料对兔骨髓基质细胞（marrow stromal cell,MSC)增殖及分化的影响。方法；采用细胞培养及组织化学等方法对各材料组兔MSC的增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphase,ALP)的活性和染色、细胞贴壁率及I型胶原表达进行研究。结果：（1）各组材料对细胞贴壁率及促增殖作用的影响总体上由强到弱依次是：对照组2→实验组→对照组1[纤维蛋白胶（fibrin sealant,FS)]→对照组3→单纯对照组，差异有显著性（P＜0．05）。（2）各组细胞的I型胶原表达水平和ALP活性由强到弱依次是：实验组→对照组3→对照组1→对照组2→单纯对照组，差异有显著性（P＜0．05）。结论：以纤维蛋白胶为载体的注射型骨修复材料可显著保进MSC贴壁率和向成骨细胞方向的分化水平。     

恒河猴骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

[目的]体外分离培养非人类灵长类动物恒河猴骨髓MSCs,研究其生长、扩增及诱导分化为成骨细胞的特性.[方法]梯度离心法分离、纯化恒河猴骨髓源MSCs,观察不同接种密度和换液时间对细胞生长的影响;在体外应用成骨添加剂(含地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L)或rhBMP-2(100 ng/L)定向诱导分化,对分化后的细胞进行免疫组化染色和ALP、BGP定量测定以鉴定成骨细胞,并比较两种定向诱导分化方法的效果.[结果]梯度离心法分离、纯化得到的恒河猴骨髓源MSCs具有分裂和克隆增殖的能力,种植细胞密度为10×104～30×104/cm2,48 h后半量换液,以后每3 d全量换液的方法较合理,MSCs能少量表达ALP活性,分泌的钙量较少;诱导分化后的细胞具有和体内成骨细胞相同的形态学特征,ALP染色阳性,能表达Ⅰ型胶原,不表达Ⅱ型胶原,细胞融合后3 d,ALP和BGP分泌明显增加,融合后14 d细胞ALP、BGP的分泌水平略有升高,但无明显增加;采用成骨添加剂和rhBMP-2诱导分化MSCs后相同时期成骨细胞ALP活性、BGP含量无明显差异.[结论]密度梯度离心法分离得到的非人类灵长类动物骨髓源MSCs,体外培养具有分裂、克隆增殖的能力,在加有成骨细胞诱导剂或rhBMP-2的培养基里能诱导分化为成骨细胞,化学药物在定向诱导分化过程中具有和生长因子相一致的作用.     

17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用

目的观察17β-雌二醇（E2）对大鼠骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）成骨分化的作用，探索雌激素替代治疗绝经后骨质疏松的实验机制。方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，利用贴壁法纯化细胞。连续传代3次后，进行成骨细胞的诱导分化，将细胞分为4个实验组，分别添加含有0．13001—0．1nmol·L^-1 17β-E2的成骨细胞诱导分化液，同时设空白对照组。各组细胞培养第7天、14天和21天时利用放免法、酶联免疫吸附法分别测定碱性磷酸酶活性（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（bone gla protein，BGP）以及Ⅰ型胶原含量，同时在培养21天时用茜素红染色法计数各组细胞的矿化结节数。结果与对照组相比，各实验组表达ALP活性、BGP与Ⅰ型胶原含量、形成矿化结节能力随17β-E2浓度的增加而增强，呈剂量依赖性。差异均有显著性，P〈0．05。结论17β-E2能增强MSCs体外诱导成骨分化，是17β-E2在绝经后骨质疏松预防和治疗中发挥作用的实验依据。     

富血小板血浆对青山羊骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对体外培养的中国青山羊骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）增殖和成骨分化的影响,探讨PRP促进骨修复的细胞学机制。方法将体外培养第3代中国青山羊MSCs,分为对照组（单纯血清培养组）和PRP组（加入10%PRP复合培养）,通过相差显微镜观察细胞生长情况,于2、4、6、8d采用MTT法检测细胞增殖活性。将体外培养的第3代细胞分为对照组、地塞米松组（dexamethasone,DEX）组、PRP组,于培养第7天行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、第18天行矿化结节染色检测细胞成骨分化活性。结果相差显微镜下见PRP组细胞最先达到汇合,MTT法显示PRP组2、4、6、8d的平均吸光度（A）值分别为0.252±0.026、0.747±0.042、1.173±0.067、1.242±0.056明显高于对照组（A值分别为0.137±0.019、0.436±0.052、0.939±0.036、1.105±0.070）（P〈0.01）。与对照组比较,PRP组ALP阳性细胞数增多,矿盐沉积减少;DEX组ALP阳性细胞数减少,矿化结节形成明显增多。结论PRP能明显促进中国青山羊MSCs增殖,抑制MSCs向成骨细胞分化。     

重组骨生长肽对组织工程性骨肌皮瓣影响的实验研究

目的 探讨重组骨生长肽对组织工程性骨肌皮瓣的影响。方法 自2004年12月至2005年5月，采用新西兰大耳白兔36只，在其髂后上棘抽取骨髓基质干细胞进行体外培养，诱导分化为成骨细胞。然后将第3代细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）、重组骨生长肽结合，共同培养14d后，经相差显微镜、扫描电镜观察体外细胞的生长情况，最后分别将72块复合物植入36只白兔的双侧背阔肌中，构成组织工程骨肌皮瓣。含重组骨生长肽的一侧为实验组；含成骨细胞的一侧为对照组。术后6周，进行大体解剖观察，行HE染色，观察骨肌皮瓣的生长情况。结果 骨髓基质干细胞可以诱导分化为成骨细胞，钙盐沉积，可形成不透光的矿化结节。在不同时间的骨髓基质干细胞，实验组ALP活性较对照组高（P〈0.05），并表现为时间依赖性。扫描电镜显示：支架材料表面和孔隙内均有成骨细胞生长，有良好的增殖活动。两组均可形成肌骨瓣，但实验组在成骨速度、成骨质量、血管化程度等方面均优于对照组。结论 应用重组骨生长肽可成功地构建组织工程性骨肌皮瓣。     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

富血小板血浆联合钙化诱导对骨髓间充质干细胞增殖和成骨活性的影响

目的:观察富血小板血浆与地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠联合应用对体外培养的MSCs增殖和诱导成骨的影响。方法:应用密度梯度离心联合贴壁筛选法从兔髂骨骨髓中分离、纯化骨髓间充质干细胞(MSCs),取第3代MSCs随机分为3组,空白对照组加入含10%血清DMEM培养基,钙化诱导组利用含有钙化诱导剂0.1μmol/L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM培养基,联合诱导组加入含有1%PRP及钙化诱导剂的DMEM培养基,诱导培养8d。结果:MSCs传至第3代细胞多呈长梭多角形。诱导培养5d后,空白对照组碱性磷酸酶染色弱阳性,钙化诱导组碱性磷酸酶染色为阳性,联合诱导组碱性磷酸酶染色为强阳性。诱导培养21d,两诱导组钙结节茜素红染色均呈阳性,MTT法显示诱导培养第2～5d联合诱导组细胞增殖明显高于钙化诱导组(P0.05)。碱性磷酸酶定量测定显示,联合诱导组于第3d、5d和7d,OD值均高于钙化诱导组(P0.05)。结论:富血小板血浆(PRP)与地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠联合应用于MSCs的成骨诱导,优于单纯钙化诱导方法,且诱导的成骨细胞具有更好的增殖及成骨活性。     

小鼠胎肝间充质干细胞的体外成骨诱导及复合陶瓷化骨的实验研究

目的探讨小鼠胚胎肝脏间充质干细胞的体外分离培养方法，并观察其成骨分化潜能及与陶瓷化骨支架材料的复合能力。方法将小鼠胎肝组织制成单细胞悬液行原代和传代培养，流式细胞仪检测其表面标志。用化学成骨诱导体系对纯化的胎肝间充质干细胞行成骨诱导，并进行成骨功能检测。将其与经过Ⅰ型胶原表面改性的陶瓷化骨复合培养，观察细胞在其上的黏附生长情况。结果原代培养的胎肝间充质干细胞，具有集落形成能力，为梭形或多角形。易于传代，传代细胞与原代细胞大小、形态相似。流式细胞仪检测表明，传代后的细胞CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性，表达间充质干细胞的特征标志。成骨诱导7d后碱性磷酸酶染色可见有较多阳性细胞，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性；14d后，细胞碱性磷酸酶活性定量检测明显增高；28d后，矿化结节染色呈阳性。将细胞与经胶原表面改性后的煅烧陶瓷化骨复合培养。扫描电镜见载体上有大量细胞黏附于材料表面。结论小鼠胎肝间充质干细胞易于获取及传代；体外成骨诱导后可向成骨细胞方向分化；能在陶瓷化骨支架材料上黏附生长。     

组织工程骨-80 ℃低温保存的初步研究

目的：了解不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响。方法：以骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSCs）复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨，实验分为：A组，组织工程骨用添加冻存保护荆的保存液保存；B组，组织工程骨用不添加冻存保护荆的保存液保存；C组，组织工程骨未行低温保存；D组。单纯MSCs培养。A组和B组的组织工程骨于-80℃深低温保存3个月，3个月后复温冻存的组织工程骨。扫描电镜观察MSCs的黏附和分布情况，MTT法检测细胞活力，对硝基苯磷酸法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AIP）活性，流式细胞仪分析细胞周期。结果：MSCs在材料表面和孔隙内均可黏附和分布，黏附于材料的细胞活力大小依次为C组〉A组〉B组（P〈0．01，P〈0．05）。黏附于材料的细胞AIP活性大小依次为C组〉A组〉B组（P〈0．01）。各组细胞周期未见明显变化，未见异倍体细胞。结论：选择适宜的冻存保护荆对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。     

自制脱蛋白骨与骨髓基质细胞的生物相容性研究

目的 探讨表面脱钙的脱蛋白异体骨与骨髓基质细胞的生物柑容性，为骨组织工程提供合适的支架材料。方法 用经物理与化学方法处理而制得的脱蛋白骨与骨髓基质细胞（MSCs)复合培养，进行形态学观察、细胞增殖、ALP的活性、骨钙素的分泌与蛋白质含量检测；扫描电镜观察细胞在脱蛋白骨材料上的情况。结果 骨髓基质细胞能在脱蛋白骨上贴附、增殖，其生长及功能不受影响。结论 本方法所制的脱蛋白骨与MSCs具有良好的生物相容性，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程。     

PLGA-[ASP-PEG]三嵌段基质材料对骨髓间充质干细胞黏附增殖及诱导成骨分化的研究

目的：探讨聚乳酸聚乙醇酸共聚物（poly lactic acid-co-glycolic acid,PLGA）-天冬氨酸（asparagic acid,ASP）-聚乙二醇（poly ethylene glycol,PEG）三嵌段多元共聚物上骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的黏附、增殖及成骨分化情况。方法：在PLGA支架材料中引入PEG和含有多个功能位点的ASP,制成PLGA-[ASP-PEG]三嵌段高分子支架材料。将材料与MSCs复合培养,以未改性的PLGA支架材料作对照,通过沉淀法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测MSCs的黏附和增殖变化。用成骨诱导培养基培养14d和28d,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙结节染色了解MSCs成骨分化情况。结果：MSCs在PLGA-[ASP-PEG]材料表面贴壁生长,细胞数目明显多于对照组。细胞黏附率检测显示,PLGA-[ASP-PEG]表面MSCs的黏附性能和增殖能力明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。MTT比色实验显示MSCs在PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料上培养20d后,吸光度（A）值为1.336,约为对照组0.780的2倍。培养12d时,PLGA-[ASP-PEG]材料组的细胞蛋白含量为66.44μg/孔,对照组为41.23μg/孔。成骨诱导培养基培养后,ALP染色和钙结节染色均为阳性,PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料及其降解产物不影响MSCs的成骨分化。结论：PLGA-[ASP-PEG]能促进组织工程种子细胞在骨基质材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,对成骨分化无明显影响。     

强骨宝方载药血清灭活与否对成骨细胞增殖功能的影响

目的：探讨强骨宝方糖尿病鼠血清灭活与否对成骨细胞增殖的影响。方法：采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从1-2日龄SD大鼠颅盖骨中分离出成骨细胞，倒置显微镜下观察其形态，碱性磷酸酶（ALPase）染色法、钙化结节染色、Van—Gieson染色鉴定细胞后用灭活和不灭活的不同时效（灌胃3、5d，末次灌胃l、3h）、不同浓度（5％、10％、20％）的强骨宝方糖尿病模型鼠血清加入成骨细胞培养体系，作用一定的时间，应用MTT比色法检测载药血清灭活对成骨细胞增殖能力的影响。结果：强骨宝方灌胃3、5d，末次灌胃l、3h的5％、10％、20％糖尿病鼠不灭活血清与灭活组相比差异有统计学意义，以不灭活载药血清对成骨细胞增殖功能的促进作用较强（P〈0．01或P〈0．05）。结论：强骨宝方糖尿病模型鼠血清灭活与否影响成骨细胞的增殖功能，以不灭活载药血清的作用最佳。     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

脱氢表雄酮在体外对成骨细胞代谢和IL-1β的影响

目的探讨脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）对离体大鼠成骨细胞和IL-1β的影响。方法体外分离培养大鼠成骨细胞,取传一代细胞,分别给予10^-5mmoL／L、10^-7mmoL／L、10^-9mmol／LDHEA培养72h,以10^-8mmoL／L雌二醇（estradiol,E2）为阳性对照,另设空白对照组。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色鉴定成骨细胞,MTT法检测成骨细胞的增殖能力,PNPP法测定ALP活性。ELISA法测定不同浓度DHEA培养液中IL-1β的水平。结果不同浓度DHEA组成骨细胞增殖能力和ALP的活性均有上升,其中以10^-7mmoL／LDHEA组最显著（P〈0．01）,其作用和E2相似（P〉0．05）;10^-9mmoL／LDHEA组单位细胞数的ALP活性高于空白对照组（P〈0．05）。不同浓度的DHEA组IL-1β呈下降趋势,成骨细胞增殖能力及ALP活性和IL-1β成负相关。结论DHEA在体外促进大鼠成骨细胞生长和增殖,提高ALP活性,其作用可能和抑制IL-1β有关。