三种板蓝根制剂对流感病毒核蛋白表达的影响

目的探讨不同板蓝根制剂对甲型流感病毒核蛋白（NP）的作用,寻找抗流感病毒中药的有效成分。方法采用传统水煮浸法提取的板蓝根水煎液和有机溶剂浸泡法提取的板蓝根凝集素及购买的板蓝根注射液,用细胞病变效应（CPE）法测得三种制剂试验浓度分别为1.95、2.60、0.78 mg/ml。将培养的Hela细胞分为八组,质粒组转染pcDNA3.1（＋）/NP,空质粒组转染pcDNA3.1（＋）;注射液、水煎液、凝集素实验组则将板蓝根注射液、水煎液、凝集素的试验浓度分别作用于转染重组质粒pcDNA3.1（＋）/NP的Hela细胞,三种制剂对应的对照组不进行转染,仅将对应制剂作用于Hela细胞。用胶体金免疫层析法和间接免疫荧光法检测各组NP表达。结果质粒组、注射液及水煎液实验组胶体金试验阳性,免疫荧光法证实作用转染的Hela细胞仍发出较强绿色荧光,且表达的NP定位于细胞质中;而凝集素组及空质粒组中表达NP的细胞未出现较强的绿色荧光且胶体金试验阴性。结论板蓝根凝集素可抑制NP基因表达,此为研发抗流感病毒的药物提供了新思路。     

人pEGFP-GEF-H1载体的构建及其表达

背景:研究表明GEF-H1能激活Rho蛋白,与肿瘤发生、发展、浸润、迁移等密切相关。目的:构建人pEGFPGEF-H1载体并稳定转染结肠癌HCT116细胞后检测GEF-H1表达。方法:在线合成引物软件设计人GEF-H1基因引物,构建重组质粒pEGFP-GEF-H1,并转染结肠癌HCT116细胞,以转染空质粒和未转染的细胞分别作为空质粒组和空白对照组。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测GEF-H1 mRNA和蛋白表达水平。结果:成功构建了人pEGFP-GEF-H1载体,测序结果表明序列正确。转染重组质粒pEGFP-GEF-H1后,荧光显微镜下可见较强的绿色荧光,GEF-H1 mRNA和蛋白表达水平均较空质粒组和空白对照组明显上调。结论:体外成功构建了人pEGFP-GEF-H1载体,且转染结肠癌HCT116细胞后高表达GEF-H1,为进一步探讨结肠癌与GEF-H1的关系提供了必要的实验材料。     

肝细胞生长因子基因转染后对内皮祖细胞增殖、迁移、分泌一氧化氮及血管再生的影响

目的本研究拟用肝细胞生长因子(HGF)基因修饰内皮祖细胞(EPCs),以观察其对EPCs增殖、迁移、分泌一氧化氮(NO)及生血管能力的影响.方法采用梯度离心法分离并培养大鼠骨髓EPCs,荧光DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)摄取和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-Ⅰ)结合荧光双染法鉴定大鼠EPCs.细胞分为HGF转染组、阴性对照组及空白对照组,HGF组用脂质体介导法导入pIRES2-EGFP-HGF质粒,阴性对照组导入pIRES2-EGFP质粒,空白对照组不导入质粒,然后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的合成及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测细胞HGF mRNA的表达来鉴定转染的EPCs.用四唑盐(MTT)法、改良的Bodyen小室及硝酸盐还原法观察细胞增殖、移行及分泌NO能力;体外成管试验用于分析细胞生血管的能力.结果原代细胞培养4天后发现可成梭形贴壁细胞,7天后细胞成集落状,原代细胞培养21天左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列,细胞DiI-LDL摄取试验阳性,FITC-UEA-Ⅰ染色阳性.转染18h后HGF转染组及阴性对照组细胞绿色荧光蛋白检测呈阳性,转染率为40%,而空白组则呈阴性.RT-PCR结果显示,HGF转染组细胞内mRNA的表达显著高于对照组,而空白对照及阴性对照组HGF mRNA表达无显著性差异.HGF转染组细胞增殖、移行能力及分泌NO量均显著高于对照组.在ECMatrix培养基上培养12h,HGF转染组体外成管评分显著高于对照组.结论HGF基因修饰能够显著提高EPCs增殖、移行、分泌NO及生血管能力,改善EPCs的生物学功能.     

pEGFP-C3-hNIS重组质粒的构建及其在人胃癌BGC-823细胞的表达

目的构建人钠碘转运体（hNIS）基因真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并研究重组hNIS基因在人胃癌BGC-823细胞中的表达情况。方法采用Trizol一步法从甲状腺手术患者的甲状腺组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到hNIS的可编码区基因,并克隆到T载体上,测序后亚克隆到真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3的多克隆位点,获得重组真核表达载体pEGFP-C3-hNIS。分别将pEGFP-C3-hNIS重组质粒（实验组）和pEGFP-C3（对照组）瞬时转染至人胃癌BGC-823细胞中,转染48 h后,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达情况,并通过Western blot方法检测hNIS基因的蛋白表达水平。结果序列分析证实克隆片段与GenBank公布的hNIS基因序列（序列号：NM-000453）相似性达99.90%。转染48 h后,实验组与对照组细胞均可观察到较强绿色荧光信号,用hNIS基因特异性抗体检测表明实验组hNIS表达水平明显高于对照组。结论成功构建hNIS真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并能在人胃癌BGC-823细胞中高表达。     

人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控

目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.     

阻断肝再生增强因子表达对HepG2细胞转化生长因子-α及表皮生长因子受体表达的影响

目的用RNA干扰技术阻断人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration,hALR）表达,观察人肝癌细胞HepG2中转化生长因子-α（transforming growth faetor-α,TGF-α）及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表达是否受影响,以阐明hALR在促进肝癌细胞生长的相关细胞因子网络中的作用。方法将构建好的人肝再生增强因子siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B分别转染至HepG2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,计算转染效率。免疫细胞化学法检测转染细胞中hALR表达,确定抑制效果。根据转染质粒的不同,将HepG2细胞分为3组：转染组（转染pSIALR-A）、阴性对照组（转染pSIALR-B）和空白组（未转染重组质粒）。放射免疫法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞培养上清中TGF-α水平,Western blot法检测阻断肝再生增强因子后各组细胞EGFR蛋白的表达。结果转染组、空白组和阴性对照组TGF-α分别为（5.27±0.86）pg／ml、（7.92±2.65）pg／ml和（6.50±1.28）pg／ml,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义（P％0.05）;EGFR相对表达量分别为0.946±0.136、1.115±0.606和1.131±0.509,转染组与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论在促进肝癌细胞生长的细胞因子网络中,肝再生增强因子除了可以直接刺激肝癌细胞增殖外还可通过上调TGF-α及EGFR的表达水平参与肝癌的发生、发展。     

HCBP6模拟磷酸化重组质粒的构建与亚细胞定位

目的 构建HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的绿色荧光蛋白重组质粒,明确其亚细胞定位。方法 以构建含有570 bp的HCBP6外显子基因的绿色荧光蛋白重组质粒为基础,应用快速定点突变技术构建HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒。将重组质粒测序并进行序列比对。利用jetPRIME转染体系将HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒转染至细胞中,应用Real-Time PCR技术检测目的基因mRNA的表达,应用Western blot技术检测目的基因蛋白表达,应用荧光显微镜观察HCBP6不同位点磷酸化质粒的亚细胞定位。结果 将测序的重组序列与目的基因进行比对,发现重组序列与目的基因完全一致,说明HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒构建成功。RealTime PCR和Western blot表明,与对照组相比,实验组高表达HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的基因。免疫荧光显微镜可见10Ala主要在细胞质表达,WT、10Asp、151Ala、151Asp主要在细胞核表达。结论 构建的HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒可成功转染细胞并在细胞中高表达,HCB...     

PTEN基因过表达抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

目的:初步研究第10号染色体丢失的磷酸酶(PTEN)基因的过表达对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响,为冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供新思路。方法:培养大鼠胸主动脉VSMCs,通过双酶切将目的基因克隆至带有强绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的质粒中,构建重组质粒。再将细胞分为3组:转染pEGFP-PTEN质粒组、转染空载体pEGFP组、正常对照组。荧光显微镜观察转染效果。通过细胞计数法及四唑盐(MTT)比色实验检测各组VSMCs的增殖。RT-PCR检测各组细胞PTENmRNA的表达。流式细胞仪测定各组细胞的凋亡。结果:1经PCR和测序鉴定表明,携目的基因PTEN的重组穿梭质粒pEGFP-PTEN构建正确。2荧光显微镜下可见转染阳性细胞发绿色荧光,表明质粒成功转染VSMCs。3通过细胞计数、MTT法检测显示,PTEN基因抑制VSMCs生长。空载体组和对照组之间未见明显差异。5RT-PCR同时扩增pEGFP-PTEN转染组、pEGFP转染组和对照组PTENmRNA,结果显示pEGFP-PTEN转染组PTENmRNA的表达比pEGFP转染组及对照组PTENmRNA的表达显著增加(P0.05)。6流式细胞仪检测显示转染pEGFP-PTEN基因的VSMCs凋亡率约为25.10%,显著高于对照组。结论:pEGFP-PTEN成功转染体外培养的VSMCs后,PTEN在mRNA水平表达增加。通过VSMCs内PTEN过度表达能够抑制其增殖,促进其凋亡。     

钙黏蛋白13表达下调与膀胱癌生长的关联性研究

目的探讨钙黏蛋白13(cadherin-13,CDH13)表达下调与膀胱癌生长关联性及其对磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)信号通路的影响。方法应用膀胱癌5637细胞建立裸鼠成瘤模型,比较不同时间点正常对照组(以1×PBS处理5637细胞,n=7)、阴性对照组(以shRNA质粒转染5637细胞,n=7)和实验组(以CDH13 shRNA质粒转染5637细胞,n=7)的肿瘤体积。采用Western blot法检测肿瘤组织中CDH13、PI3K及p-Akt蛋白的表达情况,并比较这三种蛋白在三组间的表达差异。结果在实验期间,三组裸鼠的肿瘤体积均呈增长趋势,实验组肿瘤体积增大最快,三组变化幅度差异有统计学意义(P<0.05)。在第10天、第13天和第16天,实验组裸鼠肿瘤体积显著大于阴性对照组和正常对照组(P<0.05),而阴性对照组肿瘤体积显著大于正常对照组(P<0.05)。Western blot实验结果显示,实验组CDH13蛋白表达水平显著低于阴性对照组和正常对照组(P<0.05),而PI3K与p-Akt蛋白的表达水平则显著高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05)。结论CDH13表达下调可能通过PI3K/p-Akt信号通路促进膀胱癌的发生。     

人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞分化的实验研究

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞(hMAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性,为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法(1)取健康成人志愿者适量骨髓采用CD45、糖化蛋白A(GlyA)免疫微磁珠负分选,纯化培养CD45、GlyA hMAPCs。(2)间接共培养:将分别接种于盖玻片上的传代hMAPCs和人肝细胞系L02(密度均为1×105/ml)按照各50%比例共置于直径10 cm培养皿中,培养液共通,实现间接共培养。分别于第1、3、5、7天免疫细胞化学鉴定hMAPCs的Alb、AFP、细胞角蛋白18(CK18)、细胞角蛋白19(CK19)等肝细胞特征性表型表达变化情况,并设阳性对照(单独培养的L02细胞)和阴性对照(单独培养未经诱导的hMAPCs),计数阳性细胞比率。(3)直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的hMAPCs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50%比例混合后接种于激光共聚焦显微镜检查专用培养皿内,实现直接共培养。5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察hMAPCs表达Alb、AFP、CK18的情况。同样设阳性对照(单独培养的CFSE标记L02细胞)和阴性对照(单独培养的CFSE标记MAPCs)。镜下表达黄色荧光的细胞即是向肝细胞分化的MAPCs,为阳性细胞;单纯表达绿色荧光的细胞为未分化的MAPCs;单纯表达红色荧光的细胞为L02细胞。结果(1)间接共培养结果:AFP作为不成熟肝细胞的表型标志,在间接共培养第1天表现为强阳性表达,随后逐渐减弱,至第7天,AFP的阳性表达已经很少。而Alb在第1天有可疑阳性表达,第3天,Alb即出现较强的阳性表达,第5天,Alb的阳性表达就达到高峰,第7天,密集生长的细胞仍广泛的阳性表达Alb。第1、3天检测CK18均为阴性,至第5天CK18开始出现阳性表达,第7天CK18阳性表达较前增强。CK19在各时间点均为阴性着色。阳性对照细胞Alb及CK18有较强的阳性表达,AFP弱阳性表达,CK19阴性表达。阴性对照细胞均为阴性表达。(2)直接共培养结果:Alb和CK18检测时,较多细胞质内出现黄色荧光表达,而AFP阳性荧光表达则仅出现在极个别细胞质内,该结果与阳性对照细胞荧光表达类似,而阴性对照细胞未见有阳性荧光表达。结论(1)与人肝细胞系L02间接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化。(2)与人肝细胞系L02直接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化,且时间有提前趋势。     

绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞

目的 建立以增强型绿色荧光蛋白基因示踪骨髓间质干细胞的方法。方法 采用密度梯度离心法分离、培养免骨髓间质干细胞，以脂质体介导法转染增强型绿色荧光蛋白基因的表达质粒，荧光显微镜观察基因表达及转染效率。结果 绿色荧光蛋白在基因转染12h后开始表达，48～72h达高峰，并在1周内有较强的表达，以后逐渐减弱，4周左右仍有少量表达，转染效率与质粒、脂质体的浓度有关，外缘基因导入后不影响骨髓间质干细胞的生长和增殖。结论 脂质体介导的绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞后能安全、有效地表达，转染效率为20％～30％，是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

树突状细胞转染绿色荧光蛋白基因后生长特性和表型的变化

目的:绿色荧光蛋白(EGFP-N1)标记树突状细胞.示踪树突状细胞的生长并研究EGFP-N1对其表型表达的影响.方法:将EGFP-N1质粒转化入感受态菌DH5α中扩增,经BamHⅠ酶切鉴定后大量扩增,再提取并纯化质粒将其转染入树突状细胞,通过荧光显微镜和示踪转染前后树突状细胞的生长及表型表达的变化.结果:采用该方法可以获得纯度高的绿色荧光蛋白质粒,经过培养得到了形态典型的树突状细胞.质粒绿色荧光蛋白能够在人树突状细胞中长期稳定表达,转染后细胞表面标志CD80(81.90±2.44 vs 74.52±1.40),CD86(81.49±3.24 vs 78.61±1.64),CDla(37.42±3.25 vs 18.56±2.36)的表达量明显高于未转染细胞(均P<0.05).但是转染后细胞活性低于未转染细胞活性(67.41±3.17 vs 95.10±2.20,P<0.05).结论:绿色荧光蛋白能够示踪树突状细胞的生长及变化过程,为进一步研究肿瘤复发转移及治疗提供了一种简便的新方法.     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

抗独特型抗体NP30诱导虫卵肉芽肿细胞凋亡的分子机制

目的研究抗独特型抗体NP30诱导虫卵肉芽肿细胞凋亡的分子机制.方法 BALB/c 小鼠随机分为两组,实验组腹腔注射NP30 10 μg/次,连续3次,对照组腹腔注射生理盐水,分别在尾蚴攻击感染后第39、49、64、108、112天处死,应用免疫组化S-P法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas、FasL和c-Fos的表达,原位分子杂交检测Bax与Fas mRNA.结果虫卵肉芽肿细胞均表达Bax、Fas、FasL和c-Fos蛋白,其中实验组Bax和FasL蛋白表达均高于对照组(P<0.05);实验组Fas和c-Fos蛋白表达在第64天和第112天低于对照组,其余各时间点均高于对照组(P<0.05);Bcl-2蛋白在实验组和对照组均无表达.实验组Bax和fas mRNA表达均高于对照组.结论死亡受体Fas和FasL途径启动了NP30诱导肉芽肿细胞凋亡的信号,NP30通过凋亡相关基因Bax和c-Fos表达增强来诱导肉芽肿的细胞凋亡.     

喉癌组织中Mst1基因表达与喉癌的相关性及其对人Hep2细胞化疗敏感性的影响

目的探讨Mst1基因在喉癌发生、发展中的作用,并指导化疗用药。方法荧光定量PCR法检测74例喉癌及相应癌旁组织中Mst1 mRNA表达;实验分为实验组、空白对照组和阴性对照组,实验组转染真核表达载体pcDNA3.1-Mst1,空白对照组未转染,阴性对照组转染空载体。Western blot法检测三组Mst1蛋白表达。三组细胞培养基中分别加入0、1、3、5μg/ml顺铂（DDP）进行干预,作用12 h,MTT法测定三组细胞增殖活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果喉癌组织中Mst1 mRNA表达明显低于癌旁组织;实验组Mst1蛋白表达、细胞凋亡率明显高于空白对照组及阴性对照组,细胞增殖活力明显低于空白对照组及阴性对照组;DDP干预后,随DDP浓度增加,实验组细胞凋亡率明显升高,增殖活力明显降低。结论喉癌发生与Mst1 mRNA表达降低相关,Mst1蛋白表达增加能抑制Hep2细胞增殖并促进凋亡,并可在一定程度上增强肿瘤细胞对DDP的敏感性,可将Mst1基因作为指导喉癌化疗用药的参考指标。     

D114对K562细胞增殖的影响及Rb蛋白在Notch活化的K562细胞中的表达

目的本实验旨在探讨D114基因对白血病细胞株K562生长的影响及Rb蛋白在Notch活化的K562细胞中的表达。方法实验分正常对照组、阴性对照组(转染质粒pBudCE4.1)和实验组(转染质粒pBudCE4.1-D114)。转染48 h后,免疫印迹法检测各组蛋白D114、Rb的表达水平;用细胞计数试剂盒-8法检测各组细胞的增殖;转染48 h后,比色法检测各组细胞的caspase-3、caspase-8的活性。结果在各组K562细胞中均检测到D114及Rb蛋白的表达,实验组的D114及Rb蛋白表达比两个对照组显著增多(P<0.05);实验组较对照组caspase-3、caspase-8的活性增高明显。结论 Notch活化的K562细胞中Rb蛋白高表达,通过提高caspase-3、caspase-8的活性,诱导增殖速度减慢。     

GRHL2沉默对肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨GRHL2沉默对肺癌A549细胞的增殖、凋亡的影响。方法利用RNA干扰技术,构建GRHL2沉默慢病毒表达载体,将肺癌A549细胞分为3个组,实验组:GRHL2沉默慢病毒感染的A549细胞系;阴性对照组:空载慢病毒感染的A549细胞系;空白对照组:不给予任何处理的A549细胞系。采用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的强度,通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测肺癌A549细胞中GRHL2 mRNA和蛋白质表达水平。采用细胞计数试剂盒检测GRHL2沉默对A549细胞增殖的影响。采用Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞术分析GRHL2沉默对A549细胞凋亡的影响。结果实验组中GRHL2 mRNA及蛋白质表达水平均较空白对照组及阴性对照组显著降低(F=48.13、42.57,P值均<0.05),A549细胞的增殖能力明显下降(F=65.64,P<0.05),凋亡显著增强(F=56.76,P<0.05)。结论靶向沉默GRHL2能显著抑制肺癌A549细胞的增殖并促进其凋亡,GRHL2有望成为临床肺癌靶向治疗的新靶点。     

AT2R基因转染对血管平滑肌细胞增殖核抗原表达的影响

目的:探讨血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因体外及体内转染对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖核抗原(PCNA)表达的影响。方法:细胞爬片及大鼠颈动脉球囊损伤后,局部转染带有绿色荧光蛋白报告基因的AT2R重组腺病毒载体(pAd-AT2R)或病毒载体(pAd-GFP),于细胞转染后48h及术后14d取材,应用免疫组织化学染色、免疫荧光双标染色和激光共聚焦技术检测了VSMC及血管中AT2R与PCNA的表达关系。结果:pAd-AT2R转染VSMC后,在激光共聚焦显微镜下胞质及胞核有绿色荧光蛋白表达;同时在胞质有红色荧光AT2R表达,胞核无蓝色荧光,PCNA表达阴性,无红色荧光AT2R表达的VSMC胞核有蓝色荧光,PCNA表达阳性。pAd-AT2R在体转染大鼠颈动脉后,新生内膜及中膜中PCNA阳性表达率显著低于未转染组和pAd-GFP组[(27.29±5.81)%∶(72.25±4.47)%,(68.43±9.12)%,P<0.01];在激光共聚焦显微镜下,绿色荧光及红色荧光AT2R主要分布于新生内膜、中膜、外膜,内膜散在蓝色荧光PCNA表达,在红、绿色荧光处无蓝色荧光,PCNA表达阴性,无红、绿色荧光处,有蓝色荧光,PCNA表达阳性。结论:AT2R基因体外及体内转染可抑制VSMCPCNA表达,ATR基因转染能抑制新生内膜增生。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。