哺乳动物耳蜗Kölliker器的形态学及退化机制研究

目的　探索哺乳动物耳蜗Kölliker器退化过程中是否存在自噬现象。方法　以P1~P14的SD大鼠耳蜗为研究对象,运用HE染色和透射电镜观察Kölliker器在耳蜗早期发育过 程中的显微和亚显微形态学改变,并利用免疫组化、Western blot分子生物学实验观察自噬标记物LC3、Beclin1、P62在早期发育过程中的动态变化。结果　利用HE染色及透射电镜大鼠耳蜗Kölliker器支持细胞的形态从底回向顶回逐渐由假复层柱状上皮转变为单层立方上皮,细胞层数和数量逐渐减少,最终形成成熟的内沟区域,并观察到自噬小体。免疫组化耳蜗Kölliker器支持细胞LC3-II、Beclin1、P62呈阳性。Western blot观察到P3~P10自噬相关蛋白呈逐渐下降的趋势。结论　哺乳动物耳蜗Kölliker器退化过程中存在时间依赖性的自噬现象。     

新生大鼠Klliker器支持细胞体外凋亡及增殖的研究

目的:研究体外Klliker器支持细胞的增殖及凋亡情况,并探讨促进Klliker器支持细胞在体凋亡的可能因素。方法:采用机械分离和酶消化结合的方法提取新生大鼠Klliker器支持细胞并体外培养,通过流式细胞仪检测细胞纯度、凋亡率及凋亡周期,通过MTT法检测该细胞的生长曲线,并运用Realtime PCR及Western blot方法观察不同时间点Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2的表达规律;改变体外培养Klliker器支持细胞培养液中Ca2+、K+及谷氨酸浓度,采用MTT法检测Klliker器支持细胞的存活率。结果:Klliker器支持细胞纯度高达96.56%,呈明显的线性增长;各组细胞的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2的mRNA及蛋白的表达稳定。提高Klliker器支持细胞外液中Ca2+浓度导致细胞活性降低,而细胞外K+对Klliker器支持细胞活性的影响表现为浓度依赖性,高浓度的谷氨酸对Klliker器支持细胞有一定的保护作用。结论:大鼠Klliker器支持细胞在体外无明显凋亡,呈线性增长趋势。高浓度的Ca2+可能是引起在体Klliker器支持细胞逐渐凋亡的因素,而高浓度的K+及谷氨酸对在体Klliker器支持细胞有一定的保护作用。     

斯里兰卡肉桂碱受体在不同鼠龄大鼠耳蜗中的表达差异

目的 研究不同鼠龄大鼠耳蜗内斯里兰卡肉桂碱受体(ryanodine receptor,RyR)的差异表达.探讨RyR表达与耳蜗发育成熟的关系.方法 分别选取出生后1天(P1)、5天(P5)、10天(P10)、14天(P14)、28天(P28)以及成年SD大鼠(＞2月龄)各5只耳蜗作冰冻切片.运用免疫荧光的方法 ,比较各组大鼠耳蜗组织RyR的表达差异.结果 P1组和P5组大鼠耳蜗Corti器内RyR表达不明显,P10组出现的RyR染色均匀,而P14组大鼠耳蜗Corti器内RyR的表达出现明显特征性变化,毛细胞突触区RyR强表达,而支持细胞内的表达相对较为广泛.大鼠出生后耳蜗螺旋神经元内RyR的表达由广泛的胞内表达,逐渐趋近细胞膜突触区.结论 RyR在大鼠出生后14天表达基本成熟,与耳蜗的发育成熟基本保持一致.感觉毛细胞和螺旋神经元的RyR表达可能与神经传递等功能相关.在发育早期的螺旋神经元细胞中RyR的广泛表达,可能参与了螺旋神经元发育成熟中的细胞凋亡过程.     

新生大鼠耳蜗K(o)lliker器支持细胞ATP释放的机制

目的 观察体外培养的新生大鼠耳蜗K(o)lliker器支持细胞是否存在并释放ATP,初步探讨其释放机制.方法 选取出生后ld的Sprague-Dawley大鼠,分离耳蜗膜迷路,采用机械分离与酶消化相结合的方法获得单离的K(o)lliker器支持细胞.观察膜迷路和K(o)lliker器支持细胞的喹丫因染色情况.采用生物发光法,通过影响K(o)lliker器支持细胞ATP代谢、改变细胞内外Ca2浓度、抑制细胞内磷脂酶信号通路及添加缝隙连接半通道阻断剂,观察K(o)lliker器支持细胞释放ATP浓度的变化.结果 用喹丫因染色体外培养的K(o)lliker器支持细胞,发现胞质中存在大量绿色星点状染色.采用生物发光法检测的ATP标准曲线呈明显的对数线性关系.随着巴佛洛霉素A1浓度增加,K(o)lliker 器支持细胞培养液中ATP浓度逐渐降低,而随着己二酸二癸酯浓度的增加,培养液中ATP浓度逐渐升高;在一定浓度范围内,随着细胞外Ca2浓度增加,K(o)lliker器支持细胞ATP的释放减少,而随着细胞内游离Ca2浓度增加,K(o)lliker器支持细胞释放ATP量增加;培养液中加入甘珀酸钠或乌热酸抑制半通道后可以显著的降低ATP释放.此外,抑制细胞内磷脂酶信号通路也可以减少ATP的释放.结论 体外培养的新生大鼠耳蜗K(o)lliker器支持细胞存在并释放ATP,细胞内、外液中Ca2+浓度的变化可能通过调节半通道的开放而影响其ATP的释放.     

顺铂作用下沙鼠耳蜗细胞Bcl—2及Bax的表达

目的：通过检测应用顺铂（CDDP）前后凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白家族中Bcl-2和Bax在沙鼠耳蜗Corti氏器和螺旋神经节（SG）神经元的表达情况，探讨Bcl-2蛋白家族是否参与了CDDP诱导耳蜗细胞凋亡。材料和方法：对沙鼠进行顺后连续腹腔注射，4mg/kg，分别于给药4，5，6，7天组各处死沙鼠10只，取左侧耳蜗，做平行蜗轴的石蜡切片，用免疫组织化学方法检测连续用药不同时间后底转SG及Corti氏器的Bcl-2及Bax的表达变化情况。结果：在用药4－7天中，耳蜗底转SG及Corti氏器的Bcl-2表达不断下降，分别在用药第6天和第7天时低于正常；Bax在用药第5－7天显著高于正常。结论：CDDP作用下，Bcl-2和Bax表达发生变化，Bcl-2蛋白家族参与了CDDP诱导的耳蜗细胞凋亡。     

噪声对大鼠耳蜗基底膜凋亡诱导因子表达的影响

目的探讨噪声暴露前后凋亡诱导因子（AIF）在大鼠不同回基底膜外毛细胞的表达差异以及与噪声性聋高频听力易损性的关系。方法40只SD大鼠随机分为正常对照组和噪声暴露组：噪声暴露组给予声强为115dB SPL白噪声暴露,每天2小时,连续3天,对照组不予噪声暴露。分别于噪声暴露前1日、暴露后1、3、7、14日对两组大鼠行ABR检测,最后一次ABR检测后对两组大鼠耳蜗基底膜行鬼笔环肽—异硫氰酸荧光素(Phalloidin-FITC)染色。West-ern blot和免疫荧光染色法观察两组大鼠耳蜗不同回基底膜处AIF的表达。结果大鼠噪声暴露后与暴露前相比,ABR各频反应阈值于暴露后1天最高,随时间逐渐恢复,14天时趋于稳定,听力低频阈移约10dB,高频阈移有30dB (P<0.05);基底膜铺片FITC染色示噪声暴露组底回基底膜毛细胞较顶回缺失严重,且有纤毛排列紊乱并出现融合,而对照组毛细胞排列整齐,纤毛呈V或W型,两组间外毛细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果示,在正常情况下,顶回基底膜的AIF表达高于底回,噪声暴露后,AIF顶、底回基底膜表达均较对照组相应部位增高,且顶回较底回更为显著(P<0.05)。结论噪声暴露过程中,AIF在促凋亡的同时更发挥出了氧化还原酶的作用,因而AIF在耳蜗基底膜顶、底回的表达差异,可能是噪声性聋高频听力易损性的分子机制之一。     

质膜钙ATP酶异构体1～3在新生大鼠耳蜗基底膜的表达

目的：通过 Western blot 方法检测质膜钙 ATP 酶异构体1～3（plasma membrane Ca2＋－ATPase isoforms 1～3,PMCA1～3）在新生大鼠耳蜗基底膜（basilar membrane,BM）的表达,并检测PMCA2在单个新生大鼠耳蜗毛细胞纤毛的表达量。方法①取出生后2天（P2）和8天（P8）健康SD大鼠各4只,断头后分离出BM,提取总蛋白,分别取20μg,通过 Western blot法检测BM的PMCA1～3表达。②取P2和P8大鼠BM总蛋白3μg,通过 Western blot方法检测BM的PMCA2的表达。③取4只P8大鼠,分离出BM,提取总蛋白,分别取5、10、20μg总蛋白并取100、400和800 ng牛血清白蛋白（BSA）作为对照组,跑完电泳后将胶分为2部分,部分泳道用于SYPRO染胶,其余泳道用于 Western blot检测PMCA2的表达。结果①在20μg 的 P2和 P8大鼠BM总蛋白中,PMCA1仅有微弱的表达（分别为0．126±0．024、0．131±0．012）,PMCA2表达水平较高（分别为4．16±0．528、4．25±0．319）,PMCA3几乎没有表达（均为0）,三者间差异有统计学意义（P＜0．05）。②在3μg 的P2和P8大鼠BM总蛋白中,P8大鼠PMCA2的表达水平（4．571±0．336）高于P2大鼠（3．622±0．285）,差异有统计学意义（P＜0．05）。③PMCA2在单个P8大鼠BM的含量约为2．5 ng。结论 PMCA1～3在新生大鼠耳蜗BM的表达水平不同,PMCA2表达量最大,这可能是由于耳蜗毛细胞对这几种PMCA亚型有不同的Ca2＋调节需求。     

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶表达的影响

目的：观察顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶（calpain ）表达的影响,探讨顺铂致耳蜗毛细胞凋亡的机制。方法取出生后3 d的昆明小鼠300只（600耳）,分离出耳蜗基底膜600条,体外培养24 h后,随机分为对照组和4、8、16μg／ml顺铂组,每组150条;对照组加入2ml新鲜培养基,顺铂组分别加入2 ml含不同浓度顺铂（4、8、16μg／ml）的新鲜培养基,再继续培养24 h后,应用Hoechst 33258荧光染色观察耳蜗毛细胞凋亡情况,并应用免疫荧光染色和免疫印迹（Western blot）技术检测calpain 1（μ－calpain）和calpain 2（m －calpain）在耳蜗毛细胞的表达。结果4、8、16μg／m l顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率分别为15．63％±0．20％、38．40％±2．64％和64．24％±0．05％,均高于对照组（5．55％±0．12％）,呈现明显的量效关系;不同浓度顺铂组μ－calpain和m －cal‐pain的表达均较对照组明显增强（ P＜0．01）,且m －calpain的表达随顺铂浓度的增高而明显增强（ P＜0．01）。结论顺铂可通过calpain通路诱导小鼠耳蜗毛细胞凋亡,从而发挥毒性效应。     

大鼠耳蜗发育过程中突触素的表达差异

目的 研究大鼠耳蜗发育过程中突触素(synaptophysin,SYN)的表达差异,探讨SYN表达与听觉功能发育成熟的关系及耳蜗中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的来源.方法 选取健康SD大鼠25只,按出生后天数将其分为出生后1、5、10、14、28天组(即:P1、P5、P10、P14和P28组),每组5只,运用免疫组化的方法比较各组大鼠耳蜗中SYN的表达差异.结果 P1、P5和P10组大鼠顶回的Corti器、Kolliker器未发现SYN表达;P10组底回及蜗管中段、P14组和P28组Corti器的内、外螺旋束、Deiters细胞内侧缘有特异性表达;各组大鼠耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron,SGN)胞浆中均有SYN表达.结论 大鼠耳蜗发育过程中SYN的表达存在差异,这种差异有利于神经末梢和靶细胞间构型建立,对听觉系统发育中形成正确的听觉信息编码可能起着关键作用.毛细胞、支持细胞中的ATP可能以非囊泡或以非SYN特异性染色的囊泡形式储存.     

PDCD5和caspase3在不同年龄段C57BL/6J小鼠耳蜗中的表达

目的 检测程序化细胞死亡分子5（programmed cell death 5,PDCD5）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）在不同年龄段C57BL/6J小鼠耳蜗中的表达,初步探讨其在年龄相关性听力下降发生、发展中的作用。方法 选择3、6、9及12月龄段C57BL/6J小鼠各15只,即按月龄分为四组。检测各组小鼠双侧短声( click)及短纯音(6、8 kHz)听性脑干反应(ABR)阈值。采用免疫组化和蛋白质印迹杂交(Westem blotting)检测各月龄段小鼠耳蜗PDCD5和Caspase3蛋白的表达,实时荧光定量PCR( real-time PCR)检测各月龄段小鼠耳蜗PDCD5和caspase 3基因mRNA的表达。结果 随着年龄的增长,C57BL/6J小鼠各频率ABR阈值逐渐提高,耳蜗PDCD5和Caspase3蛋白的表达亦逐渐增强。3月龄和6月龄小鼠耳蜗毛细胞和血管纹细胞仅出现少量PDCD5和Caspase3蛋白表达,9月龄时表达有明显增加,至12月龄时表达最强,各月龄组间比较,差异具有统计学意义(P值均＜0.05)。Real-time PCR检测显示PDCD5和caspase3基因mRNA随着年龄的增长表达逐渐增强,与其蛋白变化趋势相一致。结论 C57 BL/6J小鼠耳蜗PDCD5和caspase3随着年龄的增长表达增强,与耳蜗的老化密切相关,可能是老年性聋发病机制中的一个重要因素。     

水杨酸钠对大鼠耳蜗NKCC1 mRNA表达的影响

目的研究水杨酸钠作用后大鼠耳蜗Na^＋-K^＋-2Cl^-联合转运体（Na^＋-K^＋-2Cl^-co-trans-porter,NKCC1）mRNA的表达变化情况,探讨NKCC1在水杨酸钠肌注后引起大鼠耳蜗主动性改变中的作用和意义。方法选用24只正常成年SD大鼠,随机分成四组,每组6只：正常对照组（无特殊处理）、急性组（一次肌注水杨酸钠400mg／kg后处死）、慢性组（肌注水杨酸钠175mg／kg,2次／天,连续用药14天后处死）,恢复组（给药方法及时间同慢性组,停药14天后处死）,运用荧光定量PCR技术比较四组大鼠耳蜗NKCC1mRNA的表达变化。结果NKCC1mRNA在正常对照组、急性组、慢性组、恢复组均有表达,慢性组、恢复组的表达量均高于正常组,差异均有统计学意义（P〈0．05）;急性组NKCC1mRNA的表达低于正常组,差异有统计学意义（P〈0．05）;恢复组NKCC,mRNA的表达低于慢性组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NKCC1mRNA在正常大鼠中有表达,提示其对维持内淋巴液中Cl^-的平衡有一定作用;水杨酸钠肌注可以引起大鼠耳蜗NKCC1mRNA表达变化,可能通过改变耳蜗内淋巴液Cl^-浓渡平衡,而影响外毛细胞的电能动性。     

C57BL/10J小鼠内耳形态学观察

目的 探讨不同月龄C57BL／10J小鼠内耳形态学变化。方法 取C57BL/10J小鼠2月龄3只（6耳）、8月龄3只（6耳）、12月龄2只（4耳）、27月龄2只（4耳），采用耳蜗铺片和耳蜗图技术，观察耳蜗和前庭毛细胞的变化。结果 2月龄鼠在耳蜗底回和顶回可见有少量的外毛细胞缺失，内毛细胞正常。8月龄鼠外毛细胞缺失主要由耳蜗底回向顶回发展，少量内毛细胞缺失主要在耳蜗底回，对应于20kHz的基底膜区域显示外毛细胞缺失在20％左右。12月龄鼠外毛细胞缺失明显加重，耳蜗底回部分几乎完全缺失，外毛细胞损失区域发展到基底膜中部，并且蜗尖区域外毛细胞缺失达到40％，耳蜗底回内毛细胞缺失达到60％～80％，蜗尖部分内毛细胞基本正常，对应于20kHz的基底膜区域显示外毛细胞缺失近80％，内毛细胞缺失近30％。27月龄鼠耳蜗外毛细胞从基底膜中部至底回完全缺失，顶回缺失60％～80％，内毛细胞缺失逐渐向蜗尖扩展，对应于20kHz的基底膜区域显示外毛细胞完全缺失，内毛细胞缺失超过50％。前庭选取球囊斑，椭圆囊斑和壶腹嵴三个部位进行观察，不同月龄的C57BL／10J鼠前庭毛细胞均正常。结论 本研究首次对C57BL／10J小鼠的内耳形态学进行观察，发现该鼠同C57BL／6J小鼠比较在外毛细胞缺失规律和时间上有明显的差别，明确了内耳毛细胞的变化规律；同时首次观察了前庭毛细胞，为C57BL／10J小鼠作为遗传性和老年性聋研究的动物模型提供了形态学理论依据。     

硫酸链霉素引起的大鼠体外培养耳蜗毛细胞凋亡

目的 探讨在离体培养条件下硫酸链霉素是否通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活而导致大鼠耳蜗毛细胞凋亡.方法 将出生后3～4 d的大鼠耳蜗基底膜取出进行离体培养,培养过夜后用0.1 mmol/L硫酸链霉素培养液继续培养24 h.终止培养前1 h应用碳氧荧光素标记的肽荧光甲基酮(carboxyfluorescein labeled peptide fluoromethyl ketone,FAM-peptide-FMK)标记的caspase-6,caspase-8,或caspase-9指示剂作用1 h,然后应用异硫氰酸四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽(phalloidin)标记毛细胞的纤毛和表皮板,再应用Topro-3 DNA探针对细胞核进行染色,最后在共聚焦显微镜下观察.结果 1 mmol/L硫酸链霉素引起的耳蜗毛细胞缺失在底回约为80%,在顶回约为20%.经链霉素作用后,耳蜗毛细胞的细胞核发生浓缩和碎裂,同时可见cmpase-6,caspase-8和caspase-9阳性表达.结论 硫酸链霉素可以引起离体培养的大鼠耳蜗毛细胞凋亡,上游和下游的caspase激活可能是其主要途径.     

骨髓神经组织定向干细胞移植治疗大鼠听神经损伤的实验研究

目的观察骨髓神经组织定向干细胞（nerve tissue committed stem cells, NTCSCs）移植治疗大鼠听神经损伤的作用。方法 将60只SD大鼠按数字随机法分为5组,每组各12只,A组为对照组,在平静饲养环境下培养,另外4组（B、C、D、E组）构建感音神经性耳聋动物模型。B组大鼠断头后取出听泡组织行HE常规染色,详细观察耳蜗螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons, SGNs）损伤和内耳毛细胞存活情况,确认造模成功。将绿色荧光蛋白（green fluore scent protein, EGFP）基因表达阳性的骨髓NTCSCs注射至C、D、E 3组大鼠左耳耳蜗蜗轴处,SD大鼠右耳及A组作为对照;采用同一方法注射相同体积的0.1%PBS溶液。HE染色观察耳蜗中轴切片,在荧光显微镜下观察转染EGFP基因的NTCSCS存活、分布部位及表达情况。结果C组（移植后1周）内耳耳蜗切片上发现转染绿色荧光蛋白（green fluore scent protein, EGFP）基因的骨髓NTCSCs分散在鼓阶的腔隙内,D组（移植后2周）发现转染EGFP基因的骨髓NTCSCs位置靠近基底膜和柯蒂氏器部位,E组（移植后4周）发现转染EGFP基因的骨髓NTCSCs球团和多个在一起的细胞聚集,并且位置靠近基底膜和柯蒂氏器部位,呈现良好的分布,类似有向基底膜和柯蒂氏器迁移行为。随着骨髓NTCSCs移植时间的延长,Nestin（＋）细胞数量明显增多（P〈0.05）,而Myosin Ⅶa（＋）细胞数量无明显变化（P〉0.05）。结论骨髓NTCSCs移植大鼠耳蜗后可在一定程度上修复损伤听神经。     

活性氧诱导离体大鼠耳蜗Corti器毛细胞凋亡的观察

目的探讨氧自由基中毒后耳蜗毛细胞有无凋亡及其变化规律。方法选用新生1～5d龄SD大鼠24只,随机分为4组。每组6只（12耳）：①无血清培养液组（H2O2浓度为零）;②0．05mmol／LH2O2组;③0．1mmol／LH2O2组;①0．5mmol／LH2O2组。分离Cord器,并用尖刀按顶回、中回、底回将其分为3段,分别放人相应浓度的H2O2培养液中培养．培养结束后用丫啶橙／碘化丙啶双重染色技术检测并计数凋亡的毛细胞。结果不同浓度H2O2组均检测到凋亡毛细胞,外毛细胞（OHC）是H2O2攻击的主要靶细胞,而支持细胞无凋亡。底回毛细胞损伤明显重于顶回和中回,各回外毛细胞损伤明显高于内毛细胞;随H2O2浓度增加,各回凋亡细胞增加。结论本实验条件下,外源性H2O2可直接诱导离体培养大鼠耳蜗Corti器毛细胞凋亡。支持细胞无凋亡。     

Nrf2及其信号通路相关因子在噪声性聋大鼠耳蜗的表达

目的：研究Nrf2／Keapl－ARE信号通路相关因子核因子2（nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2）、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutas 1,SOD1）、血红素加氧酶1（heme oxygenase－1,HO－1）在噪声致聋大鼠耳蜗的表达变化。方法 SD大鼠30只,随机分为噪声组15只和正常对照组15只。正常对照组不给予噪声暴露,噪声组动物给予连续12小时115 dB SPL的稳态白噪声暴露,分别于噪声暴露后1、3、7天对两组动物进行ABR和DPOAE检测,并于噪声暴露7天后取耳蜗组织运用RT －PCR技术及 Peggy Sue微量蛋白检测技术检测 Nrf2、SOD1、HO －1的表达。结果噪声暴露后1、3、7天,噪声组大鼠ABR反应阈均高于正常对照组（P＜0．05）,噪声组DPOAE幅值较正常组明显下降（P＜0．05）;噪声暴露后7天,噪声组大鼠耳蜗Nrf2、SOD1、HO －1的mRNA表达（1．11±0．05、1．45±0．12、1．15±0．03）上调,高于正常对照组（1．00±0．02、1．10±0．12、0．92±0．08）,差异均有统计学意义（P＜0．05）。Peggy Sue微量检测系统检测结果显示噪声组Nrf2及SOD1、HO －1蛋白含量均高于正常组（P＜0．05）。结论强噪声暴露后,SD大鼠耳蜗Nrf2基因表达和蛋白含量升高,Nrf2／Keapl－ARE信号通路下游抗氧化酶SOD1、HO －1基因表达和蛋白含量也随即上调,此改变可能对噪声引起的耳蜗内氧化应激损伤有一定的保护作用。     

Caspase 12在强噪声诱导下豚鼠耳蜗细胞凋亡中的作用

目的 探讨caspase 12在强噪声诱导的豚鼠耳蜗细胞凋亡中的作用.方法 选用健康雄性白色豚鼠32只,随机数字表法分为4组,将实验组动物暴露于声压级120 dB、4 kHz窄带噪声环境4 h.分别对健康对照组及噪声刺激后第1、4、14天组豚鼠测试听性脑干反应(ABR).每组取4只豚鼠耳蜗作石蜡切片,另外4只豚鼠提取耳蜗总蛋白.通过透射电镜和脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing,TUNEL)检测耳蜗凋亡细胞,免疫组化及蛋白质印迹(Western blot)法检测Bip/GRP78、caspa8e 12蛋白的表达.结果 透射电镜观察到实验组第1天耳蜗外毛细胞、螺旋神经节细胞出现凋亡的特征性改变.实验组耳蜗Corti器、侧壁的血管纹和螺旋神经节存在TUNEL阳性细胞,第1天组最多;对照组未见阳性细胞.免疫组化、Western blot检测实验组Bip/GRP78蛋白明显高于对照组,且在第1、4、14天都维持在比较高的水平;caspase 12蛋白含量在噪声刺激后迅速增高,第1、4天达到高峰,第14天表达明显下降,但仍维持较高水平.结论 强噪声可以诱导豚鼠耳蜗细胞凋亡,caspase 12活化引起内质网应激反应性凋亡通道可能是此过程的信号途径之一.     

大鼠双侧耳蜗毁损后下丘核生长相关蛋白表达研究

目的研究大鼠双侧耳蜗毁损后下丘核（inferior colliculus,IC）生长相关蛋白-43（growth-associat-ed protein43,GAP-43）表达水平的变化。方法成年健康SD大鼠35只,随机分为假手术组（对照组）和耳蜗毁损后3、7、14、21、28、90天组,每组各5只动物。应用耳蜗毁损手术法制备大鼠双侧耳蜗毁损模型,采用免疫组织化学方法检测耳蜗毁损后大鼠下丘核GAP-43的表达。结果各组大鼠双侧耳蜗毁损后下丘核内GAP-43均有表达,耳蜗毁损各组表达均高于对照组,毁损后3、7、14天GAP-43表达持续上升,14天时达高峰,21、28天逐渐下降,到毁损后90天GAP-43水平略高于正常组;除90天组外,耳蜗毁损各组的GAP-43表达水平与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。各组两耳间差异均无统计学意义。结论双侧耳蜗去传入损伤后,下丘核内GAP-43表达14天时达高峰,90天时接近正常水平,可能反映了下丘核内神经元的轴突生长及突触重塑情况。     

γ-Synuclein在不同年龄段C57小鼠内毛细胞中的差异表达

目的 观察不同年龄段C57BL/6J小鼠内毛细胞中γ-Synuclein的表达差异性,探讨其与老年性聋听力损失的可能关系。方法 随机选取出生后1月龄、3月龄、6月龄和9月龄C57BL/6 J小鼠各12只,对其进行ABR检测,取其耳蜗基底膜顶、底回进行免疫荧光染色,观察γ-Synuclein的表达差异情况。结果 各年龄段C57小鼠ABR32kHz（高频）听力阈值分别为38.75±7.42、45.00±7.39、66.25±9.80、79.58±8.38dB SPL,从6月龄开始32kHz听阈明显升高（P<0.05）,9月龄时相比6月龄进一步升高（P<0.05）。各年龄组免疫荧光染色耳蜗顶回γ-Synuclein染色完整未见缺失,底回γ-Synuclein出现选择性表达缺失,各年龄组选择性表达缺失数分别为1.08±1.00、1.25±1.22、2.75±1.91、4.42±2.11个,从6月龄开始γ-Synuclein在底回选择性表达缺失明显增加（P<0.05）,9月龄时相比6月龄进一步增加（P<0.05）。结论 γ-Synuclein选择性表达缺失增加的变化趋势与...     

新霉素致发育中大鼠毛细胞损伤的电镜观察

目的应用扫描电镜研究氨基甙类抗生素导致出生后发育过程中大鼠耳蜗毛细胞的损伤病理变化。方法７天龄ＳＤ大鼠肌肉注射８０ｍｇｋｇ－１ｄ－１新霉素连续８天,停药后７天处死动物制备样本进行扫描电镜观察。结果新霉素可造成出生后发育过程中的耳蜗毛细胞严重损伤,表现为底回和钩回三排外毛细胞全部损伤缺失,损伤病变累及顶回的外毛细胞,底回和钩回的内毛细胞出现纤毛脱落和细胞损伤丢失;外毛细胞损伤缺失的部位由顶部具有微绒毛的多边形细胞取代,该细胞形态与胚胎发育早期的毛细胞相似;毛细胞损伤区域未发现再生的毛细胞。结论出生后发育过程中大鼠耳蜗毛细胞对氨基甙类抗生素的敏感性较高,表面有微绒毛的多边形细胞在毛细胞损伤区域出现提示听觉感觉上皮细胞有再生的倾向。