RNA干扰沉默雷帕霉素靶蛋白基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的 构建靶向雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的RNA干扰表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性的影响。方法 根据大鼠mTOR基因序列设计2个短发夹环RNA（shRNA）序列，化学法合成单链寡核苷酸序列，将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN，脂质体介导转染包装细胞PT67后获得mTOR的重组逆转录病毒shRNA表达载体，感染VSMC，Northern blot和Western blot法检测mTOR及其下游底物真核细胞启动子4E结合蛋白（4E-BP1）、p70s6k等表达的变化，流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化，噻唑蓝（MTT）法检测VSMC增殖活性的改变。结果 shRNA序列插入pLXIN载体并感染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达，mTOR通路下游的核糖体蛋白S6激酶（p70s6k）表达相应减少，而4E-BP1的表达却显著增强；感染前VSMC细胞G1／Go期比例为71％，S期为15％，凋亡细胞为2％；转染后72h，G1／岛期比例为87％，S期为6％，凋亡细胞为6％（P＜0．01）；表明G0／G1→S过程受阻，VSMC的分裂、增殖受到抑制，凋亡机制启动，更多细胞停滞在G0／G1期。结论 成功构建靶向mTOR基因的shRNA表达载体，能够明显抑制VSMC分裂、分化和增殖。     

靶向Pik3cb RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨靶向磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）p110β亚单位的短发卡RNA质粒（pU6-Pik3cb-shRNA）对大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,经脂质体介导转染大鼠VSMC,分7组：A组：VSMC细胞;B组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1;C组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-2;D组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2各半量;E组：转染阴性对照无序质粒HK;F组：转染阴性对照空质粒;G组：阳性对照渥曼青霉素,应用荧光定量PCR检测VSMC中Pik3cb mRNA的表达, Western blot检测VSMC中PI3K下游蛋白Akt和mTOR表达的变化;CCK-8法检测pU6-Pik3cb-shRNA对大鼠VSMC增殖的影响;免疫荧光法检测各组细胞中PCNA的表达。结果48 h时B组、C组、D组中Pik3cb mRNA表达分别降低了75．5％、53．6％和65．8％,与对照组相比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。B组、C组、D组中PI3K下游分子磷酸化Akt和mTOR表达均下调,CCK-8结果显示pU6-Pik3cb-shRNA抑制VSMC的生长,免疫荧光结果显示B组、C组、D组中PCNA的表达明显下调。结论pU6-Pik3cb-shRNA能够有效下调Pik3cb mRNA和PI3K下游效应分子磷酸化Akt和mTOR的表达,抑制VSMC增殖。     

RNA干扰对兔血管平滑肌细胞bcl-2基因表达的影响

目的研究RNA干扰(RNAi)对兔血管平滑肌细胞(VSMCs)bcl-2基因表达的干扰效应。方法用脂质体法将构建的装载靶向bcl-2基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体(pshRNA-bcl-2质粒)转染VSMCs(基因组),以转染空载体的细胞和加DMEM的空白细胞作为对照,采用半定量RT-PCR和Westernblot法检测bcl-2基因的表达,用MTT法检测VSMCs生长情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源性bcl-2基因在转录和转译水平上的表达,基因组bcl-2的mRNA和蛋白表达较空载体组和空白对照组明显减少(P<0.01);基因组的VSMCs生长也较空载体组和空白对照组明显受到抑制(P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可明显抑制内源性bcl-2基因的表达和VSMCs生长。     

靶向RNA干扰骨桥蛋白基因的慢病毒载体对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VSMC OPN蛋白表达水平;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测沉默OPN基因后对VSMC增殖和凋亡能力的影响.结果 靶向OPN慢病毒表达载体构建成功.重组慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA转染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,OPN蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-OPN2-shRNA最为明显,达到90％以上;转染PLKO.1-OPN2-shRNA后72 h的细胞增殖能力[吸光度(A)值=0.365 ±0.011]明显低于未处理组(A值=0.941±0.028)和阴性对照组细胞(A值=0.941±0.040,P＜0.05);而早期细胞凋亡率(20.44±2.69)％和晚期细胞凋亡率(16.79±1.01)％均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向OPN慢病毒表达载体PLKO.1-OPN2-shRNA,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡.     

趋化素样因子1对大鼠血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的探讨大鼠趋化素样因子（Cklfl）在体外对血管平滑肌细胞增殖活性的影响。方法将pCDB／Cklfl真核表达载体（实验组）和空载体pCDB（对照组）分别转染COS-7细胞，获取上清液，刺激原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞，以噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况。并比较在光镜和电镜下形态学的改变。结果以10％胎牛血清稀释的实验组上清与对照组相比，MTT法检测的A值在刺激大鼠平滑肌细胞48和72h后差异有统计学意义（P〈0．05和P〈0．01，n=5）。两组细胞光镜下形态学无明显差异，电镜下经Cklfl刺激后的平滑肌细胞亚细胞器及肌丝和致密体增多。结论Cklfl在血管平滑肌的增殖过程中发挥重要作用。     

RNA干扰沉默蛋白激酶B基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的 构建靶向蛋白激酶B（PKB／Akt）基因的逆转录病毒RNA干扰表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性的影响。方法 针对大鼠PKB／Akt基因序列（NM_033230）设计多个短发夹环RNA（shRNA）序列，化学合成法合成单链寡核苷酸序列，pGEM—T载体克隆后双酶切，将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN，脂质体介导转染包装细胞PT67后获得PKB／Akt的重组逆转录病毒RNA干扰载体，感染血管平滑肌细胞（VSMC），Northern blot和Western blot法检测Akt及其下游底物-核糖体蛋白S6激酶（p70s6k）等表达的变化，流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化，噻唑盐（MTT）比色法检测VSMC增殖活性的改变。结果 shRNA序列经T载体克隆，酶切确定该片段为PKB／Akt基因shRNA序列；感染VSMC，证实其能够显著抑制PKB／Akt的mR—NA和蛋白产物表达，下游的p70s6k表达相应减少；被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻，更多细胞停滞在C0／G1期。结论 成功构建PKB／Akt基因逆转录病毒shRNA载体，感染VSMC能够明显抑制其分裂、分化和增殖。     

血管内膜增生和平滑肌细胞增殖的反义治疗

反义技术在血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的基因治疗中占有重要的地位，目前人们对反义靶基因序列，载体系统和生物学效应方面进行了深入研究，可望在血管基因治疗领域内取得一定的突破，但对反义载体的可行性和反义药物的安全性等问题尚需作进一步研究。     

RNA干扰PLK1基因表达对肝癌细胞增殖的影响

目的探讨靶向PLK1基因在肝癌基因治疗中的可行性。方法采用PLK1小干扰核糖核酸分子(siRNA)转染人肝癌HepG2细胞,分别以荧光实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因和蛋白的表达水平,观察PLK1 siRNA转染对肝癌细胞体外增殖的影响。并于转染不同时间后收集细胞,分别采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测肝癌细胞的凋亡情况。结果 PLK1基因明显抑制癌细胞体外生长(P0.05)。肝癌HepG2细胞经siRNA转染处理后,PLK1 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P0.05)。DNA电泳出现明显的梯度图谱;转染组癌细胞凋亡指数明显增加。结论 PLK1 siRNA转染可明显抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡有关。本结果为肝癌以PLK1基因治疗提供了一条新的思路。     

人arresten基因的真核表达及其对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 真核表达人arresten蛋白,并观察其对血管平滑肌细胞体外增殖的影响.方法 用脂质体介导,将含有人arresten基因的重组质粒pSecTag2-AT转染COS-7细胞;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞目的 基因mRNA表达;收集浓缩转染48 h细胞上清液,Western blot检测目的 蛋白的表达.离体培养大鼠血管平滑肌细胞,用CCK-8法检测转染细胞上清液对平滑肌细胞体外增殖的影响.结果 重组质粒pSecTag2-AT转染的COS-7细胞有目的 基因mRNA的表达;转染细胞上清液中有arresten蛋白的表达.细胞体外增殖分析显示转染细胞上清液可显著抑制血管平滑肌细胞的体外增殖(F=40.154,P＜0.01).结论 真核表达的人arresten蛋白能有效抑制血管平滑肌细胞的体外增殖,为日后开展抑制血管新生内膜增生的基因治疗奠定了基础.     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞缝隙连接Cx43介导的细胞间通讯

RNA干扰技术的效应分子是小分子短链RNA（siRNA）。本实验拟通过转染Cx43特异性siRNA检测平滑肌细胞Cx43基因表达和细胞间通讯（GJIC）功能。探讨RNA干扰技术在血管平滑肌细胞缝隙连接功能研究中的应用。     

siRNA沉默Ppif基因表达对大鼠肾细胞增殖和凋亡的影响

目的：应用小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）抑制大鼠基因Ppif的表达,探讨其对大鼠肾细胞（NRK）增殖和凋亡的影响。方法：体外化学合成针对Ppif基因的siRNA序列,在脂质体介导下转染NRK细胞,RT—PCR检测PpifmRNA表达水平,Westernblot检测Ppif蛋白表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡状况,MTT法检测细胞增殖活性。结果：PpifsiRNA转染NRK细胞24h后,所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比,起始于405、556位点的sIRNA在基因水平对Ppif无明显抑制效应（P〉0．05）;起始于198位点的siRNA在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75．25％（P〈0．05）;蛋白水平下降72．13％（P〈0．05）。MTT结果显示NRK细胞增殖能力显著增加,转染24h后,siRNA1～siRNA4细胞抑制率分别为（68．6±3．6）％、（5．3±4．3）％、（7．6±6．3）％和（4．1±4．5）％,凋亡率明显下降。结论：体外化学合成的PpifsiRNA（起始于198位点）可以有效地抑制NRK细胞Ppif的表达,从而抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。     

Hypoxia Attenuates Insulin-Induced Proliferation and Migration of Human Diabetic Infrapopliteal Vascular Smooth Muscle Cells

The proliferative effects of insulin on infrapopliteal vascular smooth muscle cells (VSMCs) have been established. We examined the effect of hypoxia in the presence and absence of insulin on the proliferation and migration of human diabetic infrapopliteal VSMCs in vitro. VSMCs isolated from the infrapopliteal arteries of male diabetic patients of identical disease and clinical patterns undergoing below-knee amputation were harvested and grown to subconfluence. Cells were then exposed to control medium (M199/1% fetal bovine serum/2% antibiotic-antimycotic) or control medium with 100 ng/mL insulin in oxygen concentrations of 17% (normoxia), 5%, and 1%. Cellular proliferation was assayed using [methyl-³H]-thymidine incorporation. Migration assays were performed using the Corning Costar Transwell^® system. Lactate dehydrogenase was assayed and compared among groups as a marker for cytotoxicity. VSMCs in normoxic conditions (17%) had a significant increase in both proliferation (100 ± 6.5% vs. 124 ± 4.7%, p = 0.007) and migration [73.2 ± 9.3 vs. 118.1 ± 14.9 cells/4 high-power fields (HPF), p = 0.03] when exposed to insulin. Of cells exposed to insulin, those at both 5% (75.9 ± 7.9%, p = 0.0001) and 1% (73.6 ± 4%, p < 0.0001) hypoxia proliferated at a significantly decreased rate compared with cells at normoxia (124 ± 4.7%). Migration of these insulin-exposed cells was significantly decreased at 1% hypoxia (63.1 ± 9.0 cells/4HPF) compared to those at normoxia (118.1 ± 14.9 cells/4HPF, p = 0.006) and 5% hypoxia (101.2 ± 10.0 cells/4HPF, p = 0.01). There were no significant differences in migration between cells at normoxia and 5% hypoxia. Finally, hypoxia and insulin exerted no significant effect on cytotoxicity. The proliferative and promigratory effects of insulin on diabetic VSMCs are attenuated in hypoxic conditions in a manner unrelated to cytotoxicity.     

坏死细胞释放IL-1对血管平滑肌细胞增殖及炎性反应的影响

目的 研究坏死血管平滑肌细胞对周围正常细胞增殖及炎性因子分泌的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 无血清低糖低氧条件下培养细胞,建立细胞坏死模型,收集坏死细胞培养上清液,用于干预正常血管平滑肌细胞.实验设坏死上清组、IL-1组、坏死上清+IL-1RA组和对照组.MTT法检测各组细胞增殖情况;RT-PCR检测各组MCP-1、IL-6和IL-8 mRNA的表达;ELISA检测各组MCP-1、IL-6和IL-8的分泌;Western blot检测各组NF-kB的激活情况.结果 NCS组和IL-1组细胞增殖能力均显著高于对照组(P＜0.01),NCS+IL-1 β组细胞增殖能力显著低于NCS组和IL-1组(P＜0.01);NCS组和IL-1 β组MCP-1、IL-6、IL-8 mRNA的表达均显著高于对照组(P＜0.05),NCS+IL-1RA组MCP-1、IL-6、IL-8 mRNA的表达均显著低于NCS组和IL-1组(P＜0.05);NCS组和IL-1 β组的MCP-1、IL-6及IL-8蛋白的分泌均显著高于对照组(P＜0.05),NCS+IL-1RA组MCP-1、IL-6和IL-8蛋白的分泌显著低于NCS组及IL-1组(P＜0.05);NCS组和IL-1组NF-kB的活性显著高于对照组(P＜0.05),与NCS组和IL-1组相比NCS+IL-1RA组NF-kB的活性显著降低(P＜0.05).结论 坏死血管平滑肌细胞能够促进正常细胞的增殖,诱导NF-kB的激活以及炎性因子的释放,并且这种促进作用可能与IL-1的大量释放有关.     

腺病毒介导胸苷激酶基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生抑制作用的研究

目的探讨以腺病毒为载体介导胸苷激酶（tk）基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生的抑制作用。方法腺病毒载体携tk及β-半乳糖苷酶（lacZ）基因转染人的大隐静脉平滑肌细胞及大隐静脉片，以不同浓度的更昔洛韦（GCV）培养。通过X-gal染色观察标记基因lacZ的表达效率。将转染tk基因阳性与tk基因阴性的平滑肌细胞以不同的比例混合培养观察旁观者效应。将转染tk基因的静脉片在含有GCV的培养液中培养14d，取标本进行HE、VG染色，辅以计算机图像分析，观察内膜增生情况。结果腺病毒载体能有效地转染培养的平滑肌细胞和静脉片中的平滑肌细胞，外源基因表达持续14d。平滑肌细胞增殖受抑制程度与GCV的浓度和tk表达的水平呈正相关。转染lacZ的平滑肌细胞则不被GCV抑制。混合细胞培养（tk阳性及tk阴性细胞混合），当10％的细胞表达tk基因时，细胞生存率下降了55％。在静脉片培养实验中，tk／GcV组与对照组（lacZ／GcV和tk／GCV^-）比较，前者内膜增生60％受到抑制。结论tk基因合并GCV治疗具有抑制平滑肌细胞增殖和移植静脉内膜增生的作用，tk基因治疗具有旁观者效应。     

Elastin Degradation Accelerates Phosphate-Induced Mineralization of Vascular Smooth Muscle Cells

Medial layer vascular calcification is common in patients with end-stage kidney disease. Inorganic phosphate has been shown to accelerate the transformation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) into osteoblast-like cells, which is thought to be a major process of medial layer calcification. Although elastin degradation is associated with medial layer calcification, the linkage between elastin degradation and the transformation of VSMCs remains to be clarified. We investigated the involvement of elastin degradation in the transformation of VSMCs. Rat VSMCs were isolated and cultured with a normal- (NP, 1.0 mM) or high- (HP, 2.5 mM) phosphate medium. An elastin-derived peptide, α-elastin (500 μg/ml), was also added to the normal- (NP + E) or high- (HP + E) phosphate medium. After a culture period of 2 weeks, von Kossa staining revealed mineralization in the HP group, which was accelerated by α-elastin, whereas α-elastin did not affect the mineralization at a normal phosphate concentration. The gene expression of osteoblastic differentiation factors, i.e., Runx2 or osteocalcin (OC), in VSMCs was significantly increased in the HP (Runx2 P < 0.05, OC P < 0.05) and HP + E (OC P < 0.05) groups compared with the NP and NP + E groups. Both gene and protein expressions of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) were significantly increased in the HP group compared with the NP and NP + E groups (P < 0.01, respectively). This increment was augmented in the HP + E group (P < 0.01). These results suggest that elastin degradation would accelerate or stabilize the process of VSMC transformation, which is induced by high phosphate through the upregulation of TNAP.     

Effects of L-arginine on Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Apoptosis after Balloon Injury

Objective—Vital exhaustion (VE) and a hypercoagulable state both have been associated with coronary artery disease (CAD). Candidate mechanisms by which VE predicts CAD events are impaired fibrinolysis and inflammatory changes, the latter also affecting hemostasis. We investigated whether VE and inflammation would independently relate to hemostasis.

Design—Study participants were 217 (mean age?±?SD, 40?±?9 years) apparently healthy men and women working at an airplane manufacturing plant in Germany who completed the Shortened 9‐item VE Maastricht Questionnaire. All subjects had a set of classic cardiovascular risk factors assessed, and plasma levels of fibrin D‐dimer, type I plasminogen activator inhibitor (PAI‐1) antigen, C‐reactive protein (CRP), and tumor necrosis factor (TNF)‐α were measured.

Results—PAI‐1 correlated with VE (r?=?0.18, p?=?0.009), CRP (r?=?0.20, p?=?0.004), and TNF‐α (r?=?0.18, p?=?0.009); D‐dimer correlated with CRP (r?=?0.16, p?=?0.018). In linear regression analyses, VE and TNF‐α independently explained 2 and 1%, respectively, of the variance in PAI‐1.

Conclusion—Our study corroborates previous findings on impaired fibrinolysis in VE. The findings suggest that VE and inflammation may impair fibrinolysis by different pathways, and independently of traditional cardiovascular risk factors.     

内放射对兔颈动脉术后中膜平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的　通过血管内放射防治颈动脉内膜剥脱术 (CEA)后再狭窄 ,动态观察其对中膜平滑肌细胞(SMC)凋亡和增殖的影响 ,并初步探讨其防治再狭窄的可能机理。方法　 4 0只兔行CEA后 ,随机分为 4组 ,分别给予 0Gy、10Gy、2 0Gy及 4 0Gy放射剂量的3 2 P ,于术后 3d、7d、14d、2 8d及 5 6d分别处死动物 ,取出血管标本进行病理组织学分析。结果　术后除 3d及 7d外 ,对照组发生明显内、中膜增生及管腔狭窄 ,而内放射组可见内、中膜增生明显受抑制 ,管腔面积缩小显著减轻 (P<0 .0 5 )。SMC凋亡率和细胞增殖核抗原 (PCNA)阳性细胞均于术后 3d增加 ,7d时达高峰 ,治疗组与对照组比较差异有显著性意义 (P<0 .0 1) ;2 0Gy和 4 0Gy的作用明显强于 10Gy组 (P<0 .0 1)。结论　内放射治疗可能是通过抑制SMC增殖、迁移 ,诱导SMC凋亡 ,防治再狭窄 ,并且随剂量呈递增效应 ;球囊损伤后早期以细胞增生和凋亡为主要表现 ,晚期表现为内、中膜面积的增加