Survivin基因反义寡核苷酸增强胃癌细胞对顺铂的敏感性研究

目的探讨survivin基因的反义寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对胃癌细胞系(SGC7901)下调化疗药物的耐药性的研究.方法采用survivin基因反义ODN及其对照序列(空白对照和错配ODN)通过脂质体途径分别转染SGC7901细胞.经转染的各组SGC7901细胞分别采用蛋白印迹法观察survivin基因的表达、通过MTT法检测顺铂对癌细胞的毒性作用以及流式细胞仪(FCM)观察顺铂(CDDP)诱导各组SGC7901细胞的凋亡.结果经转染反义ODN之胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降,反义ODN伴CDDP联合作用的细胞抑制率达49.9±2.1%,而单独应用CDDP或错配ODN联合CDDP的细胞抑制率分别为30.7±2.9%及34.8±3.4%,两者间呈明显差异(P＜0.01).细胞流式仪分析显示对照组、survivin反义ODN组、survivin错配ODN组的细胞凋亡率分别为8.1±0.9%、15.2±0.7%、8.5±0.8%,反义ODN组细胞凋亡率明显高于对照组、错配ODN组(P＜0.01).结论Survivin基因反义ODN能增强胃癌细胞株SGC7901对顺铂的敏感性,为临床提供一种增强化疗敏感性研究的途径.     

端粒酶基因在脑胶质瘤中的原位表达

目的 :研究端粒酶基因 (hTR)在脑胶质瘤中的原位表达状况及其与分型、分级的关系 ,评估其对胶质瘤诊断的价值。方法 :用原位杂交技术检测了 79例甲醛固定、石蜡包埋的胶质瘤蜡块标本中端粒酶基因 (hTR)的表达状况并分析与组织学分级、WHO分型之间的关系。用ABC法检测PCNA的表达。 6例正常脑组织作对照。结果 :端粒酶基因 (hTR)在脑胶质瘤中的检出率为 5 9 2 % (4 7/ 79)。端粒酶基因 (hTR)在胶质瘤组织学分级中的分布为Ⅱ级 11/ 32 ,Ⅲ级 12 / 2 0 ,Ⅳ级 2 4 / 2 7,各级胶质瘤组间比较 ,差异有显著意义 ,P <0 0 5。端粒酶基因 (hTR)的表达强度与胶质瘤的组织学分级、WHO分型之间有相关性 ,P <0 0 5 ,Ⅲ级、Ⅳ级的检出率明显高于Ⅱ级。正常脑组织中未检出端粒酶基因。端粒酶阳性组与阴性组PCNA阳性细胞密度差异有显著意义 ,P <0 0 5。结论 :胶质瘤中端粒酶基因 (hTR)表达状况可能与胶质瘤的分化程度、组织学分级相关 ,提示端粒酶基因的过表达可能对胶质瘤的演化和进展具有一定重要作用 ,并可能作为胶质瘤的一个新的诊断标志物 ,结合PCNA评价胶质瘤的生物学行为更为可靠。     

XIAP反义寡核苷酸抑制胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡的体外实验研究

目的观察X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞系BT325的增殖及凋亡的影响。方法将XIAP全硫代反义寡核苷酸，通过脂质体途径转染BT325脑胶质瘤细胞。用CCK-8实验检测细胞杀伤率，RT-PCR和Western blot技术检测XIAP的mRNA和蛋白表达，JC—1检测细胞线粒体膜电位，流式细胞仪检测细胞凋亡率，比色法检测Caspase-3活性。结果XIAP反义寡核苷酸能够抑制BT325脑胶质瘤细胞的增殖；XIAP反义寡核苷酸使XIAP的mRNA和蛋白表达均明显下调，mRNA较对照组减少了67．8％，蛋白较对照组减少了63．3％；反义寡核苷酸使线粒体膜电位下降，诱导BT325细胞凋亡，反义寡核苷酸组的凋亡率为54．7％，错义链组为14．O％，两组比较，差异具有显著性（P〈0．05）；反义寡核苷酸使BT325细胞Caspase-3活性明显增高，与对照组比较差异有显著性（P〈0．05）。结论XIAP可能参与了脑胶质瘤细胞BT325的增殖和凋亡，下调XIAP可抑制BT325细胞增殖及促进其凋亡。     

c-myc反义寡核苷酸对卵巢癌细胞COC1/DDP顺铂耐药的逆转作用

目的：探讨c-myc反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）逆转人卵巢癌细胞顺铂（cisplatin,又称DDP）耐药的可行性。方法：以卵巢癌DDP耐药细胞株COC1/DDP为研究对象,实验组以脂质体为载体分别将c-myc ASODN、c-myc正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotide,SODN）转染到COC1/DDP细胞内,阴性对照组细胞以同体积的培养液转染。采用计数法检测转染细胞增殖变化,MTT法检测DDP对细胞增殖的抑制率,RT-PCR、免疫组织化学技术分别检测转染细胞及c-myc ASODN治疗后裸鼠移植瘤c-myc mRNA及蛋白的表达,研究c-myc ASODN逆转癌细胞耐药及降低肿瘤恶性表型和成瘤能力的作用。结果：实验组转染ASODN后COC1/DDP细胞增殖被抑制;对DDP的敏感性提高,细胞生长抑制率增高,与SODN组及阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。ASODN转染后COC1/DDP细胞的c-myc mRNA和蛋白表达均明显降低,与相同浓度SODN转染组、阴性对照组的COC1/DDP细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。裸鼠腹水瘤模型中ASODN＋DDP治疗组与单纯DDP治疗组及SODN＋DDP治疗组相比较,腹水少、腹腔内瘤块少且体积小、移植瘤中c-myc mRNA和蛋白的表达均明显降低。结论：体外、体内实验中c-myc ASODN均能有效地逆转卵巢癌细胞DDP耐药性,c-myc反义寡核苷酸可望成为一种有效的卵巢癌治疗方法。     

以端粒酶为靶的肿瘤反义核酸治疗

端粒酶是一种新的肿瘤标志物和肿瘤治疗靶点。以端粒酶为靶的反义核酸研究进展迅速并且抑癌效果明显 ,与 2 5A (5′ phosphorylated 2′ - 5′ linkedoligoadenylate)的连接更使其具有了特异性诱导凋亡的作用。作为一项刚起步的研究 ,它也面临挑战和困难。综述了近年来不同的反义核酸抑制端粒酶活性的研究进展。     

hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Raji细胞凋亡的影响

目的利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Raji细胞端粒酶活性后,探讨顺铂对Raji细胞凋亡的影响.方法采用苔盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与顺铂联合作用对Raji细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪分析细胞凋亡.结果hTERT ASODN作用于Raji细胞24 h再加入顺铂,对细胞抑制明显增强(P＜0.05).加入顺铂作用后48 h,细胞出现典型的凋亡形态学改变,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带.凋亡细胞百分率(25.24±1.58)%,与正义寡核苷酸与顺铂联合作用组、单用顺铂作用组比较有显著性差异(P＜0.01).结论hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Raji细胞凋亡.     

端粒酶正义及反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的影响

背景与目的:近年研究表明,端粒及端粒酶与肿瘤发生密切相关。端粒酶反义寡核苷酸直接作用于端粒酶或诱导肿瘤细胞分化均可使端粒酶活性下降,抑制肿瘤生长。而用端粒酶反义寡核苷酸直接抑制端粒酶活性是否可引起肿瘤细胞再分化,尚不清楚。由于端粒DNA重复序列是以端粒酶RNA为模板合成的,因此端粒DNA可以和端粒酶正义寡核苷酸互补结合。这种结合是否也能影响肿瘤细胞的生长,值得研究。本研究正是要探讨端粒酶正义及反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的作用。方法:脂质体介导正、反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测细胞角蛋白表达,同时观察细胞形态学变化。结果:端粒酶正义寡核苷酸与反义寡核苷酸一样可抑制CNE1和CNE2Z细胞的生长,且呈剂量和时间依赖性。1.5、3.0、4.5、6.0μmol/L正义寡核苷酸处理CNE1细胞,6h抑制率分别为16.28%、19.38%、22.48%和23.26%,48h分别达26.26%、38.89%、39.90%和38.89%;CNE2Z细胞6h抑制率分别为7.69%、8.24%、18.13%和20.32%,48h分别为28.84%、28.88%、32.89%和31.54%。正、反义寡核苷酸组细胞角蛋白表达显著增加(P<0.01),细胞形态趋向分化成熟。结论:端粒酶正、反义寡核苷酸均可抑制鼻咽癌细胞的生长,并促进细胞分化。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞的作用

目的　观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株的作用。方法　用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人肝癌细胞株共同温育一定时间后 ,观察细胞形态变化 ,检测细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。结果　端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1 期前出现亚二倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。结论　端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端粒合成 ,从而抑制肝癌细胞的增殖     

反义c-myc对MCF-7细胞端粒酶活性的影响

目的研究脂质体LipfectAMINE^TM（LR）介导的c-myc反义寡核苷酸（ASODN）对MCF-7细胞端粒酶活性的影响及其机制。方法端粒重复序列扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳（TRAP-PAGE）及端粒重复序列扩增酶联免疫吸附测定（TRAP-ELISA）定量检测不同时间段MCF-7细胞的端粒酶活性,流式细胞仪检测c-myc蛋白表达。结果TRAP-PAGE结果显示,c-myc ASODN对MCF-7细胞的作用,随时间的递增（24h、48h、72h）,端粒酶梯度条带明显地减少,端粒酶活性明显降低。TRAP-ELISA显示,2．5μmol／L的c-myc ASODN作用MCF-7细胞48h吸光度A值降为0．486±0．041,作用72hA值降为0．263±0．034,与未经任何处理的MCF-7细胞A值0．684±0．031相比,端粒酶活性明显受到抑制,分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。未经任何处理的MCF-7细胞c-myc蛋白阳性率为（99．684±2．937）％,经c-myc ASODN作用48h c-myc蛋白阳性率低至（61．295±2．825）％,c-myc ASODN作用72h c-myc蛋白阳性率低至（29．482±2．726）％。而c-mye正义寡核苷酸（SODN）无上述作用。结论c-myc ASODN能有效降低MCF-7细胞端粒酶活性和c-myc蛋白表达。     

端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制裸鼠移植瘤生长的研究

背景与目的许多研究已证明:端粒酶的激活在肺癌的发生、发展中具有重要作用,因而成为肺癌基因治疗的重要靶点之一。本研究旨在探讨针对人端粒酶RNA成分的反义寡核苷酸对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法应用人肺腺癌细胞株A549细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,18只荷瘤裸鼠随机分为反义寡核苷酸组(Antisense Oligodeoxynucleotide Group,Group ASODN)、正义寡核苷酸组(Sense Oligodeoxynucleotide Group,Group SODN)和生理盐水对照组(Normal Saline Group,Group NS),每组6只,瘤体内分别注射反义寡核苷酸/阳离子脂质体复合物、正义寡核苷酸/阳离子脂质体复合物和生理盐水,均为每日1次,共14次,观察移植瘤的生长情况。结果反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组的体积抑瘤率分别是43.94%、6.91%,统计学检验有非常显著性差异(t=6.17,P<0.001)。治疗过程中裸鼠对药物耐受良好,无恶心、呕吐等消化道症状,未见皮下出血,治疗结束时各组裸鼠的体重较治疗开始时略有增加。结论瘤体内注射脂质体包封的端粒酶RNA的反义寡核苷酸能够明显抑制裸鼠体内移植瘤的生长。     

端粒酶活性与卵巢癌细胞系药物敏感性的关系

目的探讨端粒酶活性与上皮性卵巢癌细胞系药物敏感性的关系.方法使用顺铂作用于敏感细胞株A2780及耐药细胞株AD60.在四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定耐药倍数的基础上,应用聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)方法测定端粒酶活性.结果经MTT测定卵巢癌耐药细胞株AD60的耐药倍数为2.4.A2780端粒酶活性随药物浓度的递增明显降低,而AD60降低不明显.结论端粒酶活性与上皮性卵巢癌细胞对细胞毒性药物的敏感性相关.     

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

 目的　研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响 。方法　ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。结果　0.6 μmol／L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P＜0.05）,端粒酶相对活性降至52 %;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31 %,PI染色显示细胞被阻止在G1／G0期,S期及G2／M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰。结论　ASPSODN靶向 hTERT 能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡。     

下调miR-93表达抑制人脑胶质瘤细胞生长和侵袭的研究

目的 验证下调miR-93表达对人脑胶质瘤细胞株的生长和侵袭抑制作用.方法 合成miR-93抑制物,应用脂质体转染人脑胶质瘤细胞以抑制其表达,实时定量PCR检测转染后miR-93表达情况,流式细胞术检测、四甲基偶氮噻唑法(MTT)试验和软琼脂克隆形成实验评价细胞生长变化,tran-swell实验检测细胞侵袭能力的变化.结果 转染miR-93抑制物后,细胞中miR-93高表达被明显抑制,细胞周期进展迟滞,S期细胞减少,生长速度减慢,克隆形成能力减弱,穿过matrigel胶的细胞数减少,侵袭能力被抑制.结论 下调miR-93表达可抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭.     

bcl—2反义核酸提高白血病HL60细胞对米托蒽醌的敏感性

目的 探讨下调HL60细胞bcl-2基因表达对米托蒽醌（MIT）细胞毒作用的影响。方法 将针对bcl-2基因编码区141-147密码子的反义寡核苷酸（ASODN）作用于HL60细胞,测定其mRNA表达,细胞生长。细胞凋亡。结果 12.5umol/LASODN作用于HL60细胞48h可以下调bcl-2mRNA表达40%。0.5umol/LMIT作用于经ASODN预处理48h的HL60细胞5h,50.9%的细胞发生凋亡,明显高于MIT单独作用诱导的细胞凋亡（25.6%);当ASODN与0.7nmol/LMIT共同作用时,细胞存活率（48h)由MIT单独作用时的73.7%降至25.6%。结论 bcl-2ASODN可下调bcl-2基因表达,促进细胞凋亡而增加MIT抗肿瘤作用。     

β-连环蛋白反义cDNA对肝癌细胞恶性表型的影响

目的：探讨应用反义核酸技术降低细胞内β—连环蛋白水平对人肝癌SMMC-7721细胞恶性表型的影响。方法：构建β—连环蛋白反义cDNA重组质粒，转染人肝癌SMMC—7721细胞，筛选β—连环蛋白低表达株，研究其恶性细胞表型的变化。结果：转染β—连环蛋白反义质粒后，低表达β—连环蛋白的SMMC—7721中c-myc基因表达降低，细胞形态向未转化方向变化，细胞生长受到抑制，软琼脂克隆形成率下降，细胞周期发生改变，G0—G1期增加，S期减少。结论：降低β—连环蛋白表达可显著抑制7721细胞的恶性表型。     

hTERT基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ,ｈＴＥＲＴ）基因的反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,ＡＳＯＮＤ）对Ｋ５６２细胞端粒酶活性的影响。方法：采用多聚酶链反应－酶联免疫测定（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）方法检测人工合成的反义脱氧寡核苷酸处理Ｋ５６２细胞前后端粒酶活性的改变,以逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分