环介导恒温扩增技术研究进展

环介导恒温扩增技术(LAMP)是2000年由日本学者开发的一种新型核酸体外扩增技术。LAMP不仅广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原微生物检测,而且可以进行单核苷酸多态性分析。LAMP具有灵敏度高、特异性好、可定量分析、反应时间短、操作简单等优点,特别适合在基层实验室推广应用。随着LAMP技术的不断进展,其在标本前处理、引物设计、产物的特异性可视化检测方面也日臻完善。     

恒温扩增技术在病原体检测中的应用

<正>感染性疾病是最重要的公共健康卫生问题之一,据世界卫生组织统计,全世界每年有1 300万以上的人群死于感染性疾病[1]。感染性疾病主要由细菌和病毒引起,其次是真菌和寄生虫。某些不同的病原体感染可引起临床症状相似,但致病机制、发病进程完全不同,需要采取不同治疗方法。早期及时确定感染原因,合理使用抗菌药物可使严重感染的生存率下降5倍[2]。因此,对于发病率和病死率非常高的感染性疾病,早期     

恒温核酸扩增方法的建立及其扩增产物的鉴定

建立一种快速，简便的恒温核酸扩增方法。用ＡＭＶ ＲＴａｓｅ，ＲＮａｓｅ Ｈ，Ｔ７ＲＮＡ聚合酶以及相应的缓冲成分组成的恒温扩增系统，对４例丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒Ｅ区ＲＮＡ序列进行扩增，并通过Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交及限制性内切酶对扩增产物进行鉴定。经９０分钟或１８０分钟反应后均可扩增出预期大小的产物，放射自显在预期位置出现阳性杂交信号。     

交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用

目的探讨交叉引物扩增技术(CPA)快速检测系统在结核病诊断中的价值。方法收集唐山市第四医院2015年3~5月206例结核病就诊患者的痰液标本,其中肺结核患者95例(其中痰涂片阳性26例,阴性69例),非结核患者111例,分别采用RT-PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)检测标本中的结核分枝杆菌,对结果进行统计分析。结果涂片法、罗氏培养法、EasyNAT~TB-CPA法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为:27.37%(26/95)、50.53%(48/95)、56.84%(54/95)、51.58%(49/95)。以罗氏培养结果为诊断金标准,EasyNAT~TB-CPA法灵敏度为89.58%(43/48),特异度94.94%(150/158);RT-PCR法的灵敏度为83.33%(40/48),特异度94.30%(149/158);EasyNAT~TB-CPA与RT-PCR法相比,总体一致性为98.54%(203/206),Kappa指数值为0.92。结论 TB-CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值,且方法简便、快速。     

RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定鸟分枝杆菌

目的建立RNA恒温扩增技术快速鉴定鸟分枝杆菌(RIARD-MA)的方法,评估鉴定分枝杆菌临床分离株的应用效果。方法以鸟分枝杆菌(MA)的16S rRNA的特异序列为检测靶标,设计RNA探针和带有T7启动子的逆转录扩增引物,42℃恒温扩增实时检测,对21种分枝杆菌标准株、4株非分枝杆菌和259株分枝杆菌临床分离株进行鉴别检测;同时以PCR测序结果为参考对照。结果 RIARD-MA可以在2 h内完成检测,能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株及4株非分枝杆菌检测中的MA,检测灵敏度达103CFU/mL;检测分枝杆菌临床分离株中MA的敏感性、特异性均可达100%。结论 RIARD-MA鉴定MA具有较高的敏感性、特异性,检测快速,有望作为一种新的MA临床分离株鉴定方法。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中淋球菌的分析

目的 评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)检测淋球菌(NG)的特异性和敏感性.方法 对218例疑似患者生殖道拭子行SAT,PCR和NG培养检测,同时对对应的218份尿液标本行SAT检测.结果 SAT平行检测同一来源的拭子标本和尿液标本,检测结果 完全一致.与NG培养法相比,SAT对尿液/拭子标本的检测灵敏度为100.00%,特异性为99.27%;与PCR法相比,SAT对尿液/拭子标本的检测灵敏度为100.00%,特异性为97.08%.SAT法对拭子标本和尿液标本检测结果 的符合率为100.00%,经卡方检验,差异无显著性(χ2=0,P>0.05).结论 SAT技术检测拭子及尿液中的NG具有很高的灵敏度和特异性,与NG培养相比耗时短,与PCR相比其可用于判愈,防止过度治疗.为NG的实验室诊断提供新的检测方法.     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道生殖支原体感染的临床效果

目的探讨进行泌尿生殖道生殖支原体感染的患者,采用实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)检测的临床效果。方法选取2019年1-12月在该院男科、妇科、性病科进行泌尿生殖道生殖支原体感染检查的患者5 189例为研究对象。其中采集女性患者标本2 561例,男性患者标本2 628例。采用SAT检测是否患有支原体感染,并进行沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体等病原体的检测。结果在5 189例研究对象中有267例泌尿生殖道生殖支原体检查结果呈阳性,阳性率为5.14%,其中男性患者阳性率为7.19%(189/2 628),女性患者阳性率为3.05%(78/2 561),男性患者阳性率明显高于女性患者(P0.05)。在5 189例研究对象中,采集尿液标本患者3 162例,检查结果为阳性192例,阳性率为6.07%;采集分泌物标本患者1 967例,检查结果为阳性74例,阳性率为3.76%;采集尿液和分泌物共同标本60例,所有检测结果均一致,其中阳性患者1例,一致性为100%。在267例检查结果呈阳性的支原体感染患者中,男性患者189例,其中有121例为单纯支原体感染患者,女性患者78例,其中有19例为单纯支原体感染患者,男性单纯支原体感染率大于女性率(P0.05)。支原体与解脲脲原体合并感染率最高,且女性感染率高于男性(P0.05)。在支原体感染的患者中,年龄≤20岁的患者感染率最高,其次是20～30岁,随着年龄的增长,支原体感染率也随之降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 SAT检测泌尿生殖道生殖支原体感染的一致性较高,有较好的临床效果。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染

目的 评价实时荧光核酸恒温扩增技术（simultaneous amplification and testing, SAT）检测沙眼衣原体（CT）核酸试剂盒（RNA恒温扩增）的敏感性和特异性。 方法 对229例临床疑似患者的尿样及拭子标本同时进行SAT检测和“金标准”沙眼衣原体细胞培养检测,检测结果有差异的标本采用PCR方法对拭子标本进行复测,根据实验结果评估SAT技术在尿样及拭子标本检测中的敏感性和特异性。 结果 结合细胞培养和PCR的实验结果作为“扩大金标准”,得出SAT技术对临床拭子标本的检测敏感性为97.1%,特异性为100%;对尿样标本检测的敏感性为89.4%,特异性为99.2%。拭子和尿样标本检测结果的符合率为95.2%,经卡方检验,差异无显著性（χ^{2=3.27,P>0.05）。 结论 SAT技术检测CT试剂盒对拭子及尿样标本敏感性及特异性均较好,适用于临床实验室对CT的检测。}     

环介导恒温扩增法快速检测曲霉菌的研究

目的建立环介导恒温扩增(LAMP)检测曲霉菌的方法。方法用LAMP技术扩增曲霉菌菌株,并应用临床标本检测,同时对方法特异性、敏感性进行观察。结果所测曲霉菌菌株均获扩增产物,对其他非曲霉菌菌株无交叉反应,其检测敏感性可达0.05pg。结论LAMP方法特异性好,灵敏度高,操作简便,快速,适合从临床标本中检测曲霉菌。     

滚环扩增体系及其应用研究进展

该文对新近发展起来的恒温核酸扩增技术中的滚环核酸扩增技术及其应用研究进展进行介绍。滚环扩增技术是借鉴病原生物体的滚环复制方式而提出的,它是一种多引物的指数的体外核酸扩增技术。不仅能直接扩增特定的DNA、RNA分子,而且能实现这些靶核酸的信号放大,其灵敏度能达到1个拷贝的核酸分子。滚环扩增技术在核酸测序、单核苷酸多态性基因分型及细胞原位检测分析、DNA芯片、蛋白质芯片分析等方面都有广泛的应用前景。     

荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价

目的利用荧光恒温扩增(SAT)技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型(EV71)检测方法。方法通过设计特异性的EV71 RNA扩增引物及优化探针技术,使用M-MLV反转录酶及T7 RNA多聚酶对EV71 RNA进行核酸扩增,同时利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例,以EV71型核酸检测试剂盒作参比方法,DNA测序为第三方验证方法,对研究数据进行Kappa一致性分析。结果 SAT技术共检测到119例EV71阳性样本,其中21例荧光探针法检测为阴性,经测序证实20例样本仍为阳性。SAT与荧光探针法检测结果的Kappa值为0.789。SAT方法的敏感性100%、特异性98.77%。结论本研究建立的EV71型RNA SAT技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点,适用于临床对EV71感染的快速诊断。     

实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术和实时荧光RT-PCR在手足口病中的应用价值

目的 研究实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术和实时荧光RT-PCR在手足口病中的应用价值.方法 回顾性分析106例疑似手足口病患儿的临床资料.所有患儿均进行实时荧光RT-PCR检测、实时荧光依赖解旋酶恒温扩增技术检测,以临床表现、实验室检查、血清和病原学的综合诊断结果为临床诊断金标准,比较不同检测方法的诊断结果及效能.结果...     

核酸扩增技术及其在感染性疾病诊断中的应用

高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接检测临床标本，在较短时间内得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛，并有逐步替代传统的细菌或病毒培养的可能性。本文就与感染性疾病诊断有关的部分核酸扩增技术及其应用作一简要综述。     

恒温扩增芯片法在下呼吸道感染病原体检测中的应用

目的 评价恒温扩增芯片法在下呼吸道感染病原体检测中的应用价值.方法 选取四川大学华西医院2021年1—6月下呼吸道疑似感染患者1432例作为研究对象,采用恒温扩增芯片法检测感染病原体阳性率并与细菌传统培养法检测结果进行比较分析.结果 研究对象采用恒温扩增芯片法检测出阳性例数为597例(阳性率为41.7％),采用细菌传统...     

DNA环介导的恒温扩增技术在鉴定病原微生物中的应用

进入21世纪以来．全球流行病趋势表明．病原微生物越来越以微小多变甚至是分子的形式穿越人类空间,SARS、H5N1高致病性禽流感等疾病给人们留下了深刻的记忆。难培养和不能培养的病原微生物已经成为传染性和感染性疾病的主要根源。一些常规的病原检测方法由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处．已经愈来愈跟不上人类对病原微生物快速、简易、敏感、特异性高的鉴定要求。     

荧光环介导恒温扩增技术检测嗜肺军团菌方法的建立

目的探讨利用环介导恒温扩增技术(LAMP)建立可以准确快速检测嗜肺军团菌的方法。方法选取嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、副溶血性弧菌菌株,根据嗜肺军团菌毒力mip基因的6个特殊区域,使用Primer Explorer Version 4软件设计LAMP引物(mip-1、mip-2、mip-3),提取病原菌基因组DNA进行LAMP,评价其特异性、最低检测限和稳定性。结果筛选出mip-3引物在测定嗜肺军团菌的LAMP反应体系中扩增约10min出峰且峰值较高;非嗜肺军团菌菌株没有扩增反应;LAMP检测限可达100fg/μL;mip-3引物在10次重复检测中几乎同时出峰,稳定性良好。结论建立的LAMP检测方法具有特异性强、稳定性高特点,能快速、准确检测出嗜肺军团菌,具有较大的推广及应用前景。     

微流控芯片恒温扩增技术快速检测多种呼吸道病原体的应用

目的 利用微流控芯片恒温扩增技术(LAMP-Disk)建立多种呼吸道病原体快速检测的方法,并对其临床应用的可行性和价值进行评估。方法 设计和筛选针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的LAMP引物对,利用盘式微流控芯片建立快速检测方法。以人工构建的参考品确定LAMP-Disk方法的检出限和分析特异性。收集268份呼吸道感染患儿的咽拭子样本,使用荧光定量PCR(qPCR)法与LAMP-Disk进行平行检测,从灵敏度、特异性及总体符合率等方面比较两种方法在临床应用的相关性和差异。结果 LAMP-Disk检测方法对7种呼吸道病原体的检出限为3000～30000 copies/mL。在268份样本中,以qPCR方法为金标准,LAMP-Disk检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的灵敏度分别为90.0%、86.5%、90.6%、64.8%、75.0%、88.2%和91.4%;特异性分别为99.6%、100%、99.2%、99.5%、99.2%、99.6%和100%;总体符合率为98.9%、98.1%...     

实时荧光核酸恒温扩增技术在解脲脲原体检测中的应用

目的应用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)对不孕不育症患者的泌尿生殖道拭子及尿液进行解脲脲原体(UU)检测,并评价其敏感性和特异度。方法对452例不孕不育症患者的泌尿生殖道拭子标本,采用SAT检测法、培养法、荧光定量聚合酶链反应(PCR)进行UU检测,同时再对同一患者的尿液标本进行SAT检测,根据实验结果评估SAT在拭子及尿液标本UU检测中的灵敏度和特异度;同时UU培养阳性的标本经过临床UU规范治疗后,仍采用上述方法对患者进行UU复查,根据实验结果评估SAT在UU检测中的判断预后效果。结果初检时与UU培养结果作比较,UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.1%(170/175),特异度为97.8%(271/277),差异无统计学意义(χ2=0.010 2,P=0.919 7);UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为96.0%(168/175),特异度为98.9%(274/277),差异无统计学意义(χ2=0.163 5,P=0.686 0)。结论 SAT检测泌尿生殖道患者拭子及尿液UU检测具有很高的灵敏度和特异性,同时又有很好的判愈效果,为UU的临床实验室诊断提供了新的检测手段。     

利用环介导恒温扩增法快速检测溶组织梭菌

目的利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测溶组织梭菌的方法,研究其反应特性,以期能应用于气性坏疽临床现场检验。方法通过基因比对与引物设计,设计针对溶组织梭菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法。检测该LAMP方法对溶组织梭菌及其他干扰菌的扩增情况,对其特异性进行评价。(3)检测该LAMP方法对不同浓度溶组织梭菌的扩增情况,观察其最低检测限,对其灵敏度进行评价。结果设计出针对溶组织梭菌的LAMP检测方法。该LAMP检测方法只针对溶组织梭菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性。该LAMP检测方法对溶组织梭菌的最低检测限为1×101CFU/mL,显示其灵敏度较高。结论该试验设计出了针对溶组织梭菌的LAMP检测方法,该LAMP检测方法具有良好的特异性较高的灵敏度,能够用于溶组织梭菌的临床现场检验。