SARS-CoV 核衣壳蛋白表达方法的研究进展

2012年引起中东呼吸综合征的新型冠状病毒 hCoV-EMC,与2003年引起广东暴发性流行的严重急性呼吸综合征的 SARS-CoV 同属于β群冠状病毒,两种病毒存在许多相似之处。研究表明 SARS-CoV 核衣壳蛋白（SARS-CoV N 蛋白）可诱导产生强烈的体液和细胞免疫,是主要的抗原分子和临床诊断的最佳靶标。获得重组 SARS-CoV N 蛋白,是进一步研究 SARS-CoV、hCoV-EMC 以及其他可能出现的新型人冠状病毒 N 蛋白之间关系的前提。本文将目前研究SARS-CoV N 蛋白的重组表达体系、表达蛋白的特性及存在问题等进行了综述。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白在酿酒酵母中的表达和纯化

目的:构建重组表达质粒pYES6-N,诱导SARS冠状病毒核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein)在酿酒酵母中的表达和纯化。方法:逆转录获得SARS冠状病毒DNA片段,PCR获得核衣壳蛋白基因互相重叠的两部分片段,酶切连接成全长,在E.coliJM109中构建重组表达克隆pYES6-N,在酿酒酵母中诱导表达并纯化。结果:重组克隆pyes6-N经酶切、测序鉴定确定,插入片段大小、方向、碱基匹配与预期一致,获得一个完整的核衣壳蛋白基因,表达产物纯化后,电泳鉴定,相对分子质量近45000。结论:成功克隆SARS冠状病毒核衣壳蛋白基因全长,并在酿酒酵母中诱导表达成功,有助于抗SARS分子疫苗的研究。     

严重急性呼吸综合征

严重急性呼吸综合征(severe acute respimtory syndrome，SARS)是一种新的急性呼吸道传染病。在我国该病称为传染性非典型肺炎。本病由一种新型冠状病毒(SARS病毒)引起，主要通过近距离直接飞沫传播，临床表现为急起发热、有流感样症状和轻度呼吸道症状、肺部浸润病灶、外周血白细胞计数正常或降低、抗生素治疗无效等特征。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒多肽抗原筛选的研究

严重急性呼吸综合征(SARS)可从SARS病人分泌物中分离出SARS冠状病毒(SARS-CoV)。目前检测SARS-CoV方法有三类：分子生物学检测、免疫学检测(抗体检测)和细胞分离培养。本研究用克隆表达的SARS-CoV的各种蛋白，以重组抗原片段检测病人血清中对应抗体，并通过试验筛选出SARS-CoV表面有效性多肽抗原，进行临床研究。     

严重急性呼吸道综合征冠状病毒Spike蛋白抗原特异性的临床应用研究

目的 探讨严重急性呼吸道综合征（SARS）患者的SARS冠状病毒（SARS—CoV）抗体产生情况以及SARS-CoVSpike蛋白抗原的特异性。方法 运用酶联免疫法（ELISA）和蛋白质印迹法（WesternBlotting）检测95例SARS患者体内抗体的产生情况和验证病毒Spike蛋白抗原的特异性。结果 95例SARS患者血清抗体结果中，大部分患者出现抗体阳性，抗SARS-CoVIgM总阳性率为91．6％（87／95），抗SARS-CoVIgG总阳性率为97．9％（93／95）；高暴露人群组和正常对照组的抗SARS-CoVIgM和抗SARS-CoVIgG阳性率为0％。经过携带Spike-protein基因的重组病毒Ad-sn感染COS-1细胞后表达的s蛋白抗原，使用SARS患者抗血清能够检测出特异性蛋白条带；重组病毒感染CNE-2细胞后，表达的S蛋白抗原，能够通过不同患者抗血清同时检测到相应的特异性抗原蛋白。结论 SARS患者感染SARS-CoV后，体内可产生相应抗体；利用SARS患者所产生特异性抗血清，可以检测出克隆SARS-CoV的Spike基因所表达的Spike蛋白。     

严重急性呼吸综合征(非典型肺炎)

严重急性呼吸综合征 (SevereAcuteRespiratorySyndrome,简称SARS ,我国称之为传染性非典型肺炎 ,简称非典 )是 2 0 0 3年 2月首先在我国广东省报告 (后追溯到首例于 2 0 0 2年 1 1月 1 6日在该省佛山市出现 ) ,随后在许多国家和地区流行 ,目前已引起国际普遍关注的一种严重的肺炎。SARS可以引起高热、严重的呼吸障碍、类似流感样全身症状 ,目前在我国病死率 6%左右。截止2 0 0 3年 5月 31日 ,全球已有 32个国家或地区报告了 8360例SARS可能病例 (我国称临床诊断病例 ) ,其中我国内地报告数占 63 7% ,同时报告死亡 764例〔1〕。截止到…     

严重急性呼吸综合征患者血清SARS冠状病毒抗体IgM、IgG水平的调查研究

目的 探讨严重急性呼吸综合征患者血清SARS冠状病毒抗体IgM、IgG检测意义。方法 应用ELISA法对16例SARS患者、147例发热隔离患者、23例体格检查健康者进行血清SARS抗体：lgM、IgG检测。结果 12例SARS患者单份标本中入院标本7例有4例检出SARS抗体IgM阳性，出院5例有3例检出SARS抗体IgG阳性，2例重症患者血清动态结果观察到，从入院到出院的标本均同时检测到高滴度的SARSIgM、IgG；2例轻症SARS患者各只检测到一次SARS抗体IgM弱阳性；发热隔离区患者有6例从入院至出院均检测到SARS抗体IgG，其中两例滴度较高。健康体检者无一例SARS抗体阳性。结论 ELISA检测SARS冠状病毒抗体IgM、IgG可作为一种辅助鉴定严重急性呼吸综合征患者的临床检测和确诊手段。     

深圳3簇严重急性呼吸综合征传染链病例分析

目的：了解深圳3簇严重急性呼吸综合征(severe acute respiratery syndrome，SARS)的病例特点。方法：对深圳3簇SARS病例进行回顾性流行病学调查，分析其临床表现及实验检查结果的特点。结果：第1簇为同事2人，其中深圳首发病例1周内往返香港2次，于第2次(2003年1月14日)在香港发病；第2例从香港回深圳后发病。第2簇一家5人于广州某医院探病后1周内先后发病。第3簇为父子2人，父亲入院前2周曾往返香港。临床症状均表现高热，其中3例畏寒，5例全身肌肉酸痛，5例干咳，2例咽痛，4例头痛，2例头晕，3例于发病1周出现气喘伴腹泻并发展成ARDS。6例在发病2周内检测冠状病毒相关抗体阳性，其中1例发病后120天的IgG抗体滴度仍为1：640。死亡病例的中性粒细胞百分比及中性粒细胞绝对值增高，而淋巴细胞百分比及淋巴细胞绝对值降低，随着病情加重乳酸脱氢酶明显增高。结论：三簇病例多为异地感染发病(输入性和散发性)。在SARS病例中，检出冠状病毒相关IgG抗体。     

严重急性呼吸综合征治疗中糖皮质激素的应用

糖皮质激素 (简称激素 )是目前治疗SARS广泛应用的药物 ,随着SARS临床治疗经验的积累 ,糖皮质激素在SARS治疗中的应用引起学术界越来越多的重视。其治疗作用是肯定的 ,但存在着一些争议 ,如应用指征、剂量、疗程、撤药等。他们各自的指征如何界定 ,何时减量 ,用多大剂量、多长时间减至撤药 ,是骤然停药还是递减式撤药 ?有无限定的疗程 ?本文就目前糖皮质激素治疗SARS的一些临床经验及主要的副作用和目前争论的焦点综述如下。1　由于糖皮质激素明确的两面性 ,使它在临床使用中成为一把双刃剑。1 .1　糖皮质激素的应用指征[1 ] 　糖皮…     

磁捕法对传染性非典型肺炎冠状病毒RNA富集体系的初步研究

目的 初步研究建立磁捕法对传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒RNA的富集、纯化体系,以提高逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS冠状病毒RNA的敏感性。方法 根据国际基因库公布的SARS冠状病毒基因序列,自行设计引物、探针,体外克隆目的RNA片段作为标准物质;利用标准RNA以及模拟SARS血清标本的RNA,评价自行设计的SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系和磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的检测效果。结果SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系,对于模拟血清SARS标本RNA的最低检测样本浓度为20拷贝/μl,而磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的最低检测样本浓度为1拷贝/μl。结论 初步建立的磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系,可有效地对低浓度的RNA样本进行浓缩、纯化,有效提高SARS RT-PCR检测方法的敏感性。     

巢式逆转录聚合酶链反应检测冠状病毒的研究

目的 建立一种新的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)反应模式,以提高传染性非典型肺炎(SARS)冠状病毒检测的阳性率和研究病毒在机体的定位状态和致病机理。方法 采用两种RT-PCR反应模式检测SARS患者血浆、淋巴细胞、粪便以及肺组织中病毒核酸。结果 和常规PCR方法相比,新的PCR反应模式能显著提高标本中病毒的检出率,差别有统计学意义;急性期SARS患者淋巴细胞中病毒阳性率较高(84.6％);血浆中病毒阳性率较低(11.5％)。结论 新RT-PCR反应模式可能有利于早期诊断、筛检SARS病原体;淋巴细胞中病毒的检出率较高,提示此类标本可用于SARS实验室诊断,对分析和阐明SARS的发病机制亦可能有一定的指导作用。     

A patient with human coronavirus NL63 falsely diagnosed with COVID-19; Lesson learned for the importance of definitive diagnosis

The gold standard for the diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a nucleic acid detection test for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which may occasionally reveal false-positive or false-negative results. Herein, we describe a case of a patient infected with human coronavirus NL63 (HCoV-NL63) who was falsely diagnosed with COVID-19 using the Ampdirect? 2019-nCoV detection kit (Shimadzu Corporation, Japan) and SARS-CoV-2 Detection Kit (TOYOBO co., ltd.), and was admitted to a COVID-19 hospital ward. We suspected a cross-reaction between HCoV-NL63 and SARS-CoV-2; however, the reported genome sequences of HCoV-NL63 and N1/N2 primers for SARS-CoV-2 do not correspond. Thus, the PCR result was supposed to be a false positive possibly due to contamination or human error. Although the issue of a false-negative result has been the focus of much attention to prevent the spread of the disease, a false positive is fraught with problems as well. Physicians should recognize that unnecessary isolation violates human rights and a careful diagnosis is indispensable when the results of laboratory testing for COVID-19 are unclear. Generally, in cases such as a duplicate PCR test was partially positive, either N1 or N2 alone was positive, PCR testing for two or more target regions resulted in a positive only for single region, a high cycle threshold >35 was obtained, a false positive should be suspected. Especially, when these conditions coincide, we should recognize the high likelihood of a false positive.     

SARS抗体检测方法的建立与IgG变化规律

目的 :检测分析SARS患者血清IgG抗体产生情况 ,研究一种新的SARS冠状病毒IgG抗体检测方法的实际效果和临床意义。方法 :利用基因重组SARS冠状病毒核壳抗原 (N )建立间接ELISA法 ,检测SARS确诊、疑似患者及其他呼吸道疾病患者共 3 78份血清标本中的特异性IgG抗体。结果 :以A450 值 =2 1× 2 0 0例健康献血员均值作为抗体阳性判断的临界值 ,IgG的阳性临界值 0 2 3 9,对 160份SARS确诊病人、176份疑似病例和 42例对照病例血清IgG抗体检测结果进行分析 ,对于确诊病例发病 1周内 ,IgG抗体检测阳性率为 5 63 % ,发病第 2周 ,IgG检出阳性率为 62 86% ,第 3周为 92 5 9%。结论 :机体产生针对SARS冠状病毒核壳抗原的IgG抗体 ,在 1周后逐渐升高 ,持续时间长 ,证明在SARS冠状病毒致病转归机制中可能起重要作用 ,并且可作为SARS检测的重要手段。     

关于“SARS潜伏期应有传染性”的论证

目的搞清楚“SARS潜伏期是否有传染性”是这几个月来许多专家教授争论不休的焦点问题，以利于预防和控制好各种传染源。方法笔者通过调查研究，在8个方面认真作科学论证：（1）许多传染病（特别是病毒性和呼吸系统传染病）在潜伏期部有传染性；（2）从冠状病毒的特性看；（3）《传染性非典型肺炎密切接触者判定标准和处理原则（试行）》的暗示；（4）地坛医院等单位的不少专家教授的讲话；（5）广东省省长黄华华和医院院长田玉波的疑问：（6）我国25个省和全球31个国家／地区的流行情况：（7）某职工受染后传播9人的事实和天津“超级传染事件”这两个典型例子；（8）有上海等地的成功经验。结果发现部分人确系接触（甚至仅接触）了潜伏期的病原携带者后才忘SARS的，这项事实证明了前面的推论和说明了地坛医院等单位的专家教授的讲话是正确的。结论SARS潜伏期（实际上仅末期）应有传染性，但比发病时弱。因这期患者难发现，可能成为流行或反弹的重要传染源，故也要想办法寻找和作隔离观察。     

Fear can be more harmful than the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in controlling the corona virus disease 2019 epidemic

The current corona virus disease 2019 outbreak caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 started in Wuhan,China in December 2019 and has put the world on alert.To safeguard Chinese citizens and to strengthen global health security,China has made great efforts to control the epidemic.Many in the global community have joined China to limit the epidemic.However,discrimination and prejudice driven by fear or misinformation have been flowing globally,superseding evidence and jeopardizing the anti-severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 efforts.We analyze this phenomenon and its underlying causes and suggest practical solutions.     

IFA和ELISA在肿瘤患者血清SARS-CoV抗体测定中的对比分析

目的探讨酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光法(IFA)检测严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoY)&体在SARS病原中诊断中的特异性及其在肿瘤患者血清中的假阳性问题。方法 应用ELISA和IFA检测了111例正常对照和40例肿瘤患者血清中SARS-CoV抗体的阳性率。结果在111例正常对照和40例肿瘤患者中,IgM抗体均阴性,IgG抗体在正常对照中的阳性率为3.6%(4/111),在肿瘤患者中的阳性率17.5％(7/40),IgC抗体诊断SARS的特异性为96.4％,两种抗体同时阳性诊断SARS的特异性为100％。经IFA检测,上述SARS-CoV抗体阳性者均为阴性。结论 IFA诊断SARS的特异性为100％,ELISA诊断SARS存在一定的假阳性。应用ELISA测定SARS-CoV抗体时,应同时测定两种抗体以降低诊断的假阳性率,提高诊断的特异性。     

荧光聚合酶链反应检测严重急性呼吸综合征冠状病毒的方法建立及临床初步应用

目的 建立荧光聚合酶链反应(F—PCR)检测严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒的方法，并探讨其临床应用价值。方法 根据公布的SARS冠状病毒基因序列，自行设计合成引物、探针，应用研制的SARS F—PCR诊断试剂盒，检测115份临床漱口液样本。结果 PCR扩增产物经测序证明与SARS冠状病毒基因序列完全一致。67例确诊SARS患者漱口液中49份为阳性118例密切接触者漱口液中8份为阳性；30名健康者漱口液均阴性。结论 建立的F—PCR检测SARS冠状病毒方法可成为SARS筛查和早期诊断的一种快速、准确、有效的检测方法。