白纹伊蚊C6/36细胞登革Ⅱ型病毒结合分子的筛选

摘要：目的筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。方法提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革
Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）筛选C6/36
细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。结果C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和
阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ~Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而
阴性对照组无此条带。结论用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功
能的鉴定正在进行。
     

广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的 对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离.方法 用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6/36细胞培养患者血清中登革病毒;RT-PCR扩增C-PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析.结果 3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT-PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT-PCR和测序证实为登革3型病毒.结论 2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染.     

用地高辛配基(Digoxigenin)标记的cDNA探针检测登革热病毒

用随机引物法将地高辛标记克隆于PDW79和PDW75质粒中的登革I病毒cDNA,以碱性磷酸酶偶联体系检测地高辛-cDNA及其产物,显色灵敏度近O.1pg,感染的Den.V的细胞抽提液和登革患者血清中RNA液的最高稀释度分别为l/320和l/160~320.本报告的地高辛-cDNA探针不仅快速检出登革热病毒,而且还可以作型别鉴定,是值得推荐的新方法.     

MDCK、Vero和Hep-2细胞共培养分离甲型H1N1型流感病毒

目的用MDCK、Vero和Hep-2细胞共培养体系,分离甲型H1N1流感病毒,提高流感监测效率及缩短临床诊断周期。方法选取4株经国家流感中心复核鉴定、本实验室保存的甲型H1N1流感病毒,用病毒培养液1:2稀释后分别接种MDCK、Vero和Hep-2共培养细胞瓶和MDCK细胞瓶,每组设空白对照,用生理盐水代替接种。经35℃、5%CO2培养后记录甲型H1N1型流感病毒毒株在共培养细胞瓶和MDCK细胞瓶中的细胞病变效应(CPE)、血凝滴度和荧光定量PCR反应的CT值。结果培养后,2组接种流感病毒的细胞瓶均出现典型细胞病变,MDCK细胞瓶CPE略强于共培养细胞瓶,分离物-70℃冻融2次后检测血凝滴度,2组接种流感病毒的细胞瓶内分离物,血凝滴度均(1∶32;提取分离物核酸,荧光定量PCR检测,CT值均(20。结论用MD-CK、Vero和Hep-2细胞共培养体系可以分离流感病毒,同时还可分离鉴定其它呼吸道病毒。     

抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

采用登革Ⅱ型病毒免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,在40％PEG1000的作用下进行融合,获得6株分泌抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体的杂交瘤,用间接免疫荧光法鉴定其单克隆抗体(McAb)对登革Ⅱ型病毒均有特异性。HIA和CF试验有5株McAb为CF型特异的。5株具有HIA抑制活性。     

兔源性Ⅱ型prM多抗对Ⅰ型登革病毒无增强活性的中和作用

目的从Ⅰ型登革病毒(dengue virus,DENV)感染患者血清中分离病毒,并探究Ⅱ型登革病毒prM多抗对该病毒体外感染细胞的影响。方法用C6/36细胞分离并扩大培养Ⅰ型登革患者血清中的登革病毒,根据细胞病变收取病毒,空斑实验测定病毒滴度。免疫荧光、流式细胞术及qRT-PCR检测病毒对细胞的感染,空斑减少中和实验和抗体依赖增强感染实验测定Ⅱ型登革病毒prM抗体对病毒的中和及增强活性。结果分离扩大培养了一株Ⅰ型登革病毒,滴度达到8×10~7pfu/m L。登革病毒可以在K562细胞复制增值,ana-1细胞可以主动吞噬病毒但病毒在此细胞内不复制。0.1、1μg/m L的多抗与病毒孵育后感染BHK细胞产生的空斑数与未加入抗体的空斑数相比,差异有统计学意义(P0.001)。另外,prM多抗并没有增加登革病毒对K562细胞的感染。结论成功扩大培养DENVⅠ毒株,体外实验结果证明兔源性prM多抗是一种无增强活性的中和型抗体。     

登革2型病毒特异性抗原片段的筛选及验证

目的筛选、鉴定登革2型病毒特异性抗原,为进一步研究其生物学功能奠定基础,并利用纯化抗原建立检测登革2型病毒
抗体的ELISA方法。方法分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1-4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E蛋白
进行分析,分析登革2型病毒型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革2型病毒株中的保
守性。然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a原核表达系统进行原核表达,Western blotting验证其免疫学反应特异性,
特异性片段经亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化。结果经系统的生物信息学分析,初步
预测获得登革2型病毒特异性抗原表位8个,并对其中得分值较高的6段进行了高效表达,经Western blotting分析,获得登革2
型病毒特异性抗原片段1段。经纯化后作为检测用抗原,建立了检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。初步应用表明,所建立
方法具备良好的特异性,可检测1~200倍稀释的患者血清,S/N比值均在10以上。结论获得登革2型病毒特异性抗原片段1段,
并建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。
     

登革出血热401例临床分析

1986年海南省部份地区发生登革热流行,经 C6/36细胞分离出登革Ⅱ型病毒,我院于同年8～10月份共收治1032例,其中登革出血热(DHF)401例,占总收治数38.86%,死亡9例占2.24%,现将有关资料分析如下:     

白蚊伊蚊经卵传递登革2型病毒的实验研究

目的证明白蚊伊蚊亲代能够经卵传递登革2型病毒给子代,并且在传递过程中病毒毒力呈逐渐增强趋势。方法采用套式PCR分批检测感染雌蚊的子一代至子四代卵内登革病毒结合C6／36细胞培养分离病毒及TCID50法滴定病毒滴度。结果白蚊伊蚊能经卯传递DEN-2,至少可传四代以上：且在传代中病毒毒力有增强的趋势。结论实验证明白蚊伊蚊对登革2型病毒有较大的媒介效能,且在维持登革病毒的自然循环中起重要作用。     

登革病毒特异性重氮乳胶的研究及应用

以重氮基聚苯乙烯为载体,首次研制出登革病毒特异性重氮乳凝快速诊断试剂。玻片凝集检测登革病毒抗原,能在5分钟内出现结果,30分钟内无自凝现象。该试剂在登革病毒1—4型间交叉明显,对登革病毒以外的其它虫媒病毒无明显交叉反应。最低检出抗原量达15ng/ml 病毒蛋白水平,敏感性是血凝方法的100倍。病毒接种c/36细胞和乳鼠后的48小时之内,能分别在其培养液及鼠脑组织和血液中检出病毒抗原,明显早于细胞病变及病征的出现。该试剂在4℃保存至少半年仍具有较好的稳定性。现场应用发现,16例登革病人急性期血清,有6例呈阳性反应,其中一例经病毒分离得到证实。18例伤寒病人,4例衣原体感染病人和10例正常人血清均呈阴性反应。     

广东珠海市2007年登革病毒分子流行病学分析

目的了解2007年珠海市登革热暴发期间登革Ⅰ型（ZH1067/07）及Ⅱ型（ZH1340/07）病毒序列特征和可能的传播来源。方法以GenBank公布的病毒AB178 040和M29 095为参考,分别设计PCR引物,扩增病毒ZH1067/07和ZH1340/07全基因组的不同片段并测序,通过末端重叠序列进行拼接组成病毒全基因组序列。序列GenBank登录号分别为Eu359 008和Eu359 009。参考已公布的登革Ⅰ/Ⅱ型病毒全基因组序列进行进化分析。结果拼接后的登革Ⅰ型病毒基因组全长10 735个核苷酸,经序列进化分析,属登革Ⅰ型中的第1群（基因Ⅰ型）,与2004年分离自日本的登革Ⅰ型毒株AB178 040及分离自福建的登革Ⅰ型毒株Fj231/04核苷酸同源性最高,达99%（10 638/10735）,经流行病学证据支持福建输入病例导致珠海本地暴发;拼接后的登革Ⅱ型病毒基因组全长10 723个核苷酸,经序列的进化分析,属登革Ⅱ型病毒中的第4群（基因Ⅳ型）,与2005年分离自文莱的登革Ⅱ型EU179 857和EU179858两毒株距离最近,核酸同源性99%,（10 609/10 705）。流行病学调查证明2例均为澳门输入病例。结论2007年珠海登革Ⅰ型病毒ZH1 067/07可能来源于福建登革Ⅰ型毒株Fj231/04,与来源于密克罗尼西亚的AB178 040有很近的亲缘关系;珠海登革Ⅱ型病毒ZH1340/07可能由澳门输入,与文莱EU179 857有很近的亲缘关系,未导致珠海本地暴发。     

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响

目的：研究登革2型病毒（DENV-2）、登革2型病毒国际参考株（NGC）E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株（M）E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性的影响.方法：将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果：DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论：DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.     

登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达

目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476 bp的原核表达载体并进行原核表达.方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50.结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml.结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用.     

广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析

目的从2002年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒,明确流行株的血清型及基因型,并鉴定该分离株的毒力。方法采集疑似登革热患者血清20份,应用C6／36细胞体外培养的方法进行病毒分离,并合成登革病毒通用引物,进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)后,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对。确定血清型后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E／NS1连接区基因片段,测序后用邻位相连(N—J)法构建登革病毒进化树,分析此次登革病毒流行株的来源。通过乳鼠脑内接种及空斑实验,测定分离株的毒力。结果上述20份血清标本中,5份标本出现明显的细胞病变,主要表现为细胞融合,形成大小不一的空泡和网状结构。RT-PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型。E／NS1连接区基因序列片段分析表明,2002年广州分离株(DEN-1／GZ2002)的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN—1／T14株(澳大利亚,1981)同源性最高,达98％。N—J法构建进化树显示：11株DEN-1病毒分成3个基因群,分别与Rico-Hesse1990分型中的Ⅰ,Ⅳ和Ⅴ型以及Ana P．Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美N／tbN型相符,本室分离的DEN-1／GZ2002株属于Ⅳ型或者称南太平洋型。DEN-1／GZ2002株脑内接种乳鼠11d左右导致乳鼠弓背,后肢麻痹、瘫痪,直至死亡。感染Vero细胞8d后可见小而不透明的空斑,病毒滴度可达10^6pfu／ml,TCID50为4．37log pfu／0．2ml。结论2002年广州登革热流行为登革病毒Ⅰ型感染所致,病毒基因型为Ⅳ型,本实验虽然未明确毒力相关基因,动物实验及细胞感染实验证实该分离株的毒力较弱。     

联机血液透析滤过前后交替稀释法对肝素用量的影响

目的比较联机血液透析滤过前后交替稀释法和单纯后稀释法对肝素用量的影响。方法对33例行血液滤过的患者,进行自身对照研究。对比前后交替稀释法与单纯后稀释法血液透析滤过完成情况、肝素用量、透析器及管路凝血情况和每次透析效果(Kt/V值)。结果血液透析滤过完成情况:前后交替稀释法完成率为100%,单纯后稀释法为81.8%,差异有显著性(P<0.05),肝素用量:前后交替稀释法比单纯后稀释法减少了50%。透析器‖级以上凝血:单纯后稀释法为19%,前后交替稀释法没有Ⅱ级以上凝血发生,两种方法比较,差异有统计学意义(P<0.05);Kt/V值:前后交替稀释法为1.29±0.12,单纯后稀释法为1.28±0.10,无统计学意义(P>0.05)。结论血液透析滤过采用前后交替稀释法与单纯后稀释法相比,在保证透析效果的前提下,可以减少肝素用量,减少透析器凝血事件的发生,提高了血液透析滤过的完成率。     

登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析

目的扩增登革病毒2型新几内亚株(NGC)E基因,并进行B细胞抗原表位分析。方法根据登革2型病毒NGC株E基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增NGC株E基因并克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α后测序。按Kyte-Doolit-tle方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案预测B细胞抗原表位。结果通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,并对登革2型病毒NGC株E基因进行B细胞抗原表位预测。结论通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。     

重症医学临床救治措施中的热点与争议

【摘要】目的探讨稀释曲线法评价分化型甲状腺癌(DTC)患者内源性甲状腺球蛋白抗体(TgAb)对甲状腺球蛋白(Tg)测定的干扰。方法用血清稀释液、6例DTC患者可测浓度的TgAb血清(TgAb 20～25IU/mL、Tg<0.1μg/L)、5例DTC患者不可测浓度TgAb血清(TgAb<10IU/mL、Tg<0.1μg/L)分别稀释另外6例DTC患者的Tg血清(TgAb<10IU/mL、Tg>10μg/L),三明治夹心法(IMA)测定各稀释管Tg值。以各稀释管Tg理论值为横坐标、实测值为纵坐标,绘制稀释曲线图。结果血清稀释液稀释DTC患者Tg血清,稀释曲线呈直线。6例可测浓度TgAb血清分别稀释6例DTC患者Tg血清,获得36条稀释曲线,其中12条呈直线,24条不呈直线;同一可测浓度TgAb血清稀释不同患者Tg血清,仅部分呈直线;不同患者TgAb血清稀释同一患者Tg血清,仅部分呈直线。5例不可测浓度TgAb血清稀释3例患者Tg血清,只完成稀释曲线11条,仅4条呈直线,7条不呈直线。结论同一患者的TgAb稀释多例患者的Tg血清,部分有干扰。不可测浓度TgAb也可能干扰其他患者的Tg测定。稀释曲线法仅可间接评价DTC患者自身TgAb是否干扰Tg测定。     

登革2型病毒NGC株感染白纹伊蚊C6/36细胞中浓核病毒DNA的扩增和序列测定

目的:探索白纹伊蚊C6/36细胞对登革2型病毒(Dengue Type 2 virus,DEN2)不敏感的原因.方法:根据Genbank提供的DEN2新几内亚株(NGC株)NS1基因序列设计引物,设立病毒对照组、病毒DNA酶(DNase)处理组和细胞对照组,通过提取核酸、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、限制性内切酶(Hind Ⅲ)酶切、1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR及其酶切产物,并对其扩增产物进行序列测定,用软件比对与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒(Densonucleosis virus,DNV)基因的同源性.结果:经RT-PCR,细胞和病毒组均出现约1 300 bp的条带,不能被Hind Ⅲ酶切,而病毒DNase处理组未能扩增出此条带;经GenBank比对,该片段序列与白纹伊蚊C6/36细胞DNV部分序列的同源性达95%以上.结论:C6/36细胞对DEN2不敏感的原因是由于伊蚊C6/36 DNV的污染.     

登革2型病毒粘附人血小板的体外研究初探

目的:了解登革2型病毒(DEN-2)是否能在体外粘附人血小板并制备抗人血小板抗体.方法:密度梯度离心法分离血小板,DEN-2与血小板体外共孵育2 h,间接免疫荧光法分析DEN-2粘附人血小板情况.采用TritonX-100裂解法制备血小板蛋白并经皮下注射免疫BALB/C小鼠获取抗血小板血清,经Western blot、...     

新城疫病毒在鸡胚中增殖影响因素探讨

目的探讨新城疫病毒(NDV)Ⅱ系弱毒株在鸡胚内增殖产生血凝素的最佳条件。方法将NDV按一定浓度稀释接种到鸡胚内孵育48～72h,收获鸡胚尿囊液,测定血凝效价。结果选择9～11日龄鸡胚,种子病毒稀释10^-2～10^-3、接种剂量为0.2～0．3ml;在36℃培养48～72h时,其鸡胚尿囊液量多且血凝效价高。弱毒系产生的NDV血凝效价高于强毒系和C30克隆系病毒。鸡胚培养较鸡成纤维细胞培养产生的NDV血凝效价高。结论鸡胚的病毒接种量和孵育温度对NDV的血凝效价的影响很大,在研究NDV的血凝能力时应注意到这些问题。