人胆囊组织蛋白质表达谱的建立

目的:建立胆固醇结石病人与正常人胆囊组织的蛋白质表达谱,用于比较胆囊组织的蛋白质组学研究,为阐明胆石成因提供实验依据。方法:提取胆固醇结石病人及正常人的胆囊壁组织总蛋白,构建相应的双向电泳表达图谱,应用ImageMaster图像分析软件对双向电泳图谱进行图像分析。结果:两组样本均获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,胆固醇结石组与正常组病人组内蛋白质平均匹配点数分别为632±61和606±64,各匹配率分别为73.46%和71.49%。组间蛋白质平均匹配点为474,匹配率为70.64%。胆固醇结石病人的28个蛋白点表达上调,7个点表达下调,与正常人间蛋白表达差异明显(P0.05)。结论:初步建立了胆固醇结石病人与正常人胆囊组织的差异蛋白质表达谱,分析两者间差异蛋白点,为胆石成因研究提供实验基础。     

人去浆膜层胆囊组织蛋白质表达谱的建立与分析

目的 采用蛋白质组学技术分析胆固醇结石患者与正常人去浆膜层胆囊组织蛋白表达谱的差异,通过质谱技术鉴定差异表达蛋白,为胆石成因提供实验依据.方法 提取胆固醇结石患者和正常人去浆膜层胆囊组织蛋白,构建相应的双向电泳蛋白质表达谱并应用ImageMaster图像分析软件获得差异蛋白点信息,采用质谱鉴定差异表达蛋白质.结果 胆固醇结石患者与正常人去浆膜层胆囊组织差异蛋白质表达谱均获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,差异表达谱结果显示19个蛋白点在两者之间差异较大,质谱成功鉴定11个,1个重复.其中Tropomyosin 4（TPM4）、Transgelin （sm22）、Transthyretin （TTR）、CyanometRhbl.1、Haptoglobin-related protein precursor、Chain A,the structure of Holo type human Cu,Zn superoxide dismutase在结石组中表达上调,Myosin、Peroxiredoxin 3（Prdx3）、Hypothetical protein、T cell receptor alpha chain在结石组中表达下调.TTR、TPM4、SM22、Prdx3蛋白差异为Western blotting和RT-PCR所验证.结论 初步建立了胆固醇结石患者与正常人去浆膜层胆囊组织的差异蛋白质表达谱,分析、鉴定并验证了差异蛋白点,为胆固醇结石形成的关键调控蛋白质研究提供实验依据.     

胆结石病人肝脏核受体LRH-1及其调控基因表达的研究

目的 研究胆囊胆固醇结石病人肝脏的肝脏受体类似物1(Liver receptor homolog 1,LRH-1)及其调控的三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运体家族成员abcg5/8的表达,探讨胆固醇结石病发病的机制.方法 27例胆囊胆固醇结石病人,男6例,女21例;年龄平均52岁.10例无胆石症的胆囊息肉病人为对照,男6例,女4例;平均年龄48岁.测定胆汁脂类成分和计算胆汁胆固醇饱和指数.实时定量PCR法测定肝脏LRH-1及abcg5/8 mRNA的表达量.结果 胆石组LRH-1表达高于对照组(14.18±1.80vs7.22±2.22,P<0.05),胆石组肝脏abcg基因mRNA表达量均较对照组增高(abcg5:49.34±3.68 vs 33.48±2.77,P<0.05)abcg8:38.93±5.70 vs 18.70±3.42,P<0.05).胆石组胆汁呈胆固醇过饱和(1.17±0.02).结论 该研究结果提示人类肝脏LRH-1及其调控的abcg5/8的表达增高与胆囊胆固醇结石形成有关.     

胆囊黏膜ABCG5和ABCG8基因在胆固醇结石病中的作用

目的探讨ABCG5和ABCG8基因在胆囊黏膜中的表达与胆固醇结石病的关系。方法采集28例胆囊胆固醇结石病患者和10例无胆石对照的胆囊黏膜和胆汁、胆石。测定胆汁胆固醇、胆汁酸和磷脂含量;Real-time PCR测定胆囊黏膜中ABCG5和ABCG8的表达量。结果胆石组中胆固醇摩尔百分比和饱和指数均较对照组显著升高(P<0.01);ABCG5和ABCG8的表达呈显著正相关(r=0.55,P<0.01),胆石组中ABCG5和ABCG8的mRNA表达分别是对照组的2.8倍(P<0.01)和1.9倍(P<0.05)。结论胆固醇结石病患者的胆囊黏膜ABCG5和ABCG8基因表达增高,限制了胆囊上皮对胆固醇的吸收,使胆汁过饱和状态得以维持。     

胆囊胆固醇息肉和胆囊结石发病关系的研究

目的 探讨胆囊胆固醇息肉和胆囊结石的发生关系.方法 选择2008年4～9月上海交通大学医学院附属瑞金医院外科微创中心行腹腔镜胆囊切除术病人62例,分别收集病人的胆石、胆汁及胆囊壁全层组织,其中胆固醇息肉31例,胆固醇胆囊结石18例,对照组13例.入院后上午餐前及餐后1h行B超胆囊三径测量,计算胆囊排空率对比显示胆囊功能.测定结石胆固醇含量及胆汁胆固醇、磷脂、胆汁酸浓度,胆囊壁组织做病理检查.结果 胆固醇息肉组病人平均胆囊排空率为(47.3±18.6)%.较健康成人平均胆囊排空率(71.7±8.1)%明显降低,其差异有统计学意义(P<0.01),而胆固醇息肉组和胆固醇结石组病人平均胆囊排空率(47.6±23.7)%比较,差异无统计学意义.胆固醇息肉组胆汁胆固醇饱和指数为(1.0±0.2),较对照组胆固醇饱和指教(0.6±0.3)明显增高,其差异有统计学意义(P<0.01),而胆固醇息肉组和胆固醇结石组胆固醇饱和指数(1.0±0.2)比较,差异无统计学意义.31例胆固醇息肉病人中,合并胆囊结石13例,结石发病率为41.9%.结论 胆囊胆固醇息肉的存在可以促使胆囊结石形成.     

胆汁泡蛋白ELISA检测法的ROC曲线分析

目的　评价用ELISAkit检测胆固醇性胆结石的准确性。方法　构建胆汁 335 0 0泡蛋白检测试剂盒 ,测定正常人、胆固醇性结石症、胆色素性结石症患者胆囊胆汁泡蛋白含量 ,用受试者工作特征 (receiveroperatingcharacteristic ,ROC)曲线分析评价不同截割点含量的试剂盒诊断价值。结果　胆固醇性结石组、胆色素性结石组和正常人群组胆囊胆汁 335 0 0泡蛋白含量依次为 (2 13± 70 ) μg/ml、(72± 5 5 ) μg/ml及 (6 5± 5 2 ) μg/ml,其中胆固醇性结石组泡蛋白含量明显高于胆色素性结石组和正常人群组 (F =6 0 9,P <0 0 5 ) ;当泡蛋白截割点含量为 14 3μg/ml时 ,该ELISAkit诊断胆固醇性胆石症的敏感度、特异度和符合率分别为 85 %、90 %和 88% ,ROC曲线下面积值高达 0 96。结论　不同人群存在胆汁泡蛋白含量分布的异质性 ,ELISAkit辅助诊断胆固醇性胆结石具有潜在的临床应用价值。     

胆固醇结石病人肝脏SRBI及其转录调节因子LRH-1基因表达的研究

目的:研究胆固醇结石病人BI型清除剂受体(scavengerreceptorBtypeI,SRBI)及其转录调节因子肝脏受体类似物1(liverreceptorhomologue1,LRH-1)的表达,以探讨胆固醇结石发病的机制。方法:对20例胆囊胆固醇结石病人和10例无胆石症对照者测定血清脂质、胆汁成分和计算胆汁胆固醇饱和指数。以实时定量PCR法测定肝脏SRBI和LRH-1mRNA的表达量。结果:胆石组胆石平均胆固醇含量(86.68±5.26)%,均为胆固醇结石。胆石组病人血清高密度脂蛋白(HDL)显著低于对照组[(0.86±0.62)mmol/L比(1.42±0.56)mmol/L,P<0.01]。胆石组胆汁胆固醇在总脂中的摩尔百分比和胆固醇饱和指数显著高于对照组[(7.80±2.06)mol%比(5.26±2.80)mol%,P<0.05]。胆石组SRBI基因mRNA表达量与对照组比较显著增高(2.48±0.44比1.00±0.23,P<0.05),胆石组LRH-1表达也高于对照组(2.05±0.29比1.00±0.28,P<0.05)。结论:胆固醇结石病的主要病理生理异常为胆汁胆固醇过饱和。肝脏LRH-1、SRBI表达增高,参与了胆固醇过饱和胆汁形成,并促进了胆固醇结石形成。     

单个与多发胆固醇结石患者胆道细菌感染状况及与免疫球蛋白相关性的对照研究

目的 多发胆固醇结石患者胆囊炎症程度较高,可能与结石形成有关.对多发和单个胆固醇结石患者胆道细菌感染状况及与免疫球蛋白含量的相关性进行对照研究.方法 :用半定量PCR法测定分析38例胆囊结石患者胆石、胆汁和粘膜的细菌DNA阳性率和菌落数,并测定相应胆汁和粘膜IgA、IgG、IgM含量.结果 :单个和多发胆石组的胆汁细菌DNA阳性率分别为75.0%和73.7%,胆囊粘膜细菌DNA阳性率分别为66.7%和64.0%,结石核心的细菌DNA阳性率分别为57.1%和85.7%,结石外周细菌阳性率分别为71.4%和85.7%,两组间差异均无显著性.两组间胆汁和粘膜IgA、IgG、IgM含量差异无显著性,菌落数与免疫球蛋白含量不相关.多发胆石组粘膜细菌DNA阳性者的胆囊粘膜IgA、IgG含量高于阴性者(P<0.05).单个和多发胆石组胆汁胆固醇饱和指数(CSI)差异无显著性,各组内胆汁细菌阳性与阴性者的CSI差异也无显著性.结论 :多发和单个胆固醇结石患者胆囊细菌感染率相似,细菌感染不是多发胆固醇结石患者胆囊炎症严重的原因.多发胆固醇结石患者胆囊粘膜细菌与IgA、IgG含量增高有关,可能间接参与胆固醇结石的形成过程.     

基因芯片法检测胆囊胆固醇结石病人肝脏羧肽酶E的表达

目的:利用基因芯片和实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)分析胆囊胆固醇结石病人肝脏中羧肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)的mRNA表达,探讨CPE与胆囊胆固醇结石形成可能相关的分子机制。方法:检测病人的血清总胆固醇、三酰甘油以及胆石、胆汁成分测定。正常肝细胞株(HL-7702)为共同参照,用含10 000个cDNA克隆的芯片对8份肝脏标本样品(包括6例胆囊结石和2例无胆囊结石对照)进行基因表达谱对比分析;通过实时PCR验证阳性结果。结果:有效表达基因6 068个,与正常对照组比较,胆固醇结石病人的肝脏有67条差异表达基因,其中CPE基因呈下调表达,经实时PCR验证与芯片筛选结果一致。进一步比较另12例胆固醇结石病人和8例对照组的肝脏组织CPE表达,CPE在胆囊胆固醇结石病人肝脏中的表达也显著低于对照组(39.52±6.21比124.50±36.36,P<0.05)。结论:肝脏CPE表达下降可能与胆囊胆固醇结石的形成有关。     

胆固醇结石病人肝脏胆小管侧膜ATP基因表达差异的研究

目的:本研究旨在测定比较胆石病人与对照组肝脏胆小管侧膜转运蛋白表达差异,以探讨胆石病发生的分子生物学机制。方法:研究包括20例胆囊胆固醇结石病人和11例无胆石症的对照。测定血清胆固醇和甘油三酯、胆汁胆固醇、胆汁酸和磷脂含量,采用Carey表计算胆汁胆固醇饱和指数。实时定量PCR法测定肝脏胆小管侧膜转运蛋白(ABCG5、ABCG8、ABCBll和ABCB4)mRNA的表达量。结果:胆石组血清胆固醇低于对照组(P<0.05)。胆石组胆汁胆固醇摩尔百分比和胆固醇饱和指数较对照组显著升高(P<0.01)。胆石组肝脏胆小管侧膜胆固醇转运蛋白ABCG5和ABCG8表达高于对照组,且后者差异具有统计学显著性(ABCG5:31.44±3.17Vs25.72±3.27,ABCG8:27.53±3.06vs17.81±2.23)。ABCBll和ABCB4表达在两组间差异无显著性。结论:本研究显示,胆石病主要病理生理异常为胆汁胆固醇过饱和,与肝脏胆小管侧膜胆固醇转运蛋白ABCG5和ABCG8的mRNA表达增加有关。     

运甲状腺素蛋白在胆固醇结石胆囊组织中的表达及其促成核作用研究

目的 探讨运甲状腺素蛋白（transthyretin,TTR）基因及其蛋白在胆固醇结石患者胆囊组织中的表达情况,以及其在胆固醇结石形成中的促成核作用。方法 收集笔者所在的两所医院施行择期胆囊切除术的25例胆固醇结石患者和9例肝移植供体的正常胆囊组织,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术及Western blot法检测2组患者胆囊组织中TTR基因及其蛋白的表达。构建Small和综合模拟胆汁体系,分别加入TTR和白蛋白（ALB）,再通过Holan成核时间法和Holzbach法分别检测成核时间和成核活性。结果 胆固醇结石组TTR mRNA及其蛋白的表达水平分别为1.51±0.78和3.95±0.09,均高于正常对照组的0.85±0.63和1.53±0.08 （P＜0.05）。在Small模拟胆汁体系中,观察至21 d时,TTR组的成核时间为（14.5±1.3） d,ALB组为（18.0±0.8） d,TTR的成核活性为0.81;在综合模拟胆汁体系中,TTR组的成核时间为（13.5±0.6） d,ALB组为（18.5±1.3） d,TTR的成核活性为0.73。TTR组的成核时间均较短（P＜0.01）。结论 TTR在胆固醇结石患者胆囊组织中的表达上调,并在体外模拟胆汁体系中表现出促成核活性,提示其参与了胆固醇结石的发生和发展过程。     

人两种胆囊结石的胆汁差异蛋白质组学研究

目的 比较胆固醇性与胆色素性胆囊结石患者的胆囊胆汁蛋白质表达谱差异,寻找两种不同胆囊结石形成及调控相关的蛋白质.方法 采集胆囊结石患者胆囊胆汁及结石,结石胆固醇比例＞70%入选胆固醇结石组,胆色素比例＞40%入选胆色素结石组.胆汁予脱盐、脱脂等预处理后,二维色谱/串联质谱分析,Mascot检索数据库.结果 分别从胆固醇和胆色素结石胆汁中鉴定出495和511种蛋白质.两组共检测到抗成核因子1种,促成核因子12种,其中Mucin-5B等两种蛋白在胆固醇组高表达,载脂蛋白A-I等11种蛋白在胆色素组高表达.结论 二维色谱/串联质谱技术是高效的人胆汁蛋白质组研究技术.两组胆汁的蛋白质差异表达提示两种结石的形成机制差异,胆色素结石形成与促成核因子密切相关,载脂蛋白A-I抗成核作用减弱参与胆固醇结石形成.

Abstract：

Objective By comparing gallbladder bile samples from cholesterol cholelithiasis patients with pigment cholelithiasis patients, we try to find out proteins participating in gallstone formation for revealling two kinds of stone formation mechanisms. Methods Gallstones and bile were collected from cholelithiasis patients. These patients were divided into two groups by stone chemical compositon analysis.Patients with stone cholesterol levels greater than 70% were assigned into cholesterol stone group, and those with bilirubin levels greater than 40% into pigment stone group. After removing the bile salt and lipid, peptide fragments were separated by 2D-LC, analysed by MS/MS, and searched against Swiss Prot database by Mascot. Results There were 495 and 511 proteins identified from cholesterol stone group and pigment stone group respectively. There was 1 anti-nucleation factor and 12 pro-nucleation factors, including 2 proteins up-regulated in cholesterol stone group and 11 proteins down-regulated in pigment stone group. Conclusion 2D-LC/MS/MS is an efficient technology in bile proteomics research. Differentially expressed proteins reveal 2 kinds of different stone formation mechanisms. Pro-nucleation factors are closely related with pigment stone formation, while down-regulation of apolipoprotein A- I is closely related with cholesterol stone formation.     

人肝癌多药耐药细胞系HepG2／ADM和其亲本细胞系HepG2蛋白质双向电泳图谱的差异分析

目的建立人肝癌多药耐药细胞系HepG2／ADM和其亲本细胞系HepG2蛋白质双向电泳图谱，分析两者间蛋白质表达的差异和特点。方法采用MTT法检测HepG2／ADM和HepG2细胞对不同化疗药物的敏感性，利用双向电泳技术分离HepG2／ADM和HepG2细胞的总蛋白质，凝胶银染后，用ImageMaster 2D Platinum软件分析两者之间的差异蛋白。结果相对于正常HepG2细胞，HepG2／ADM细胞表现出明显的多药耐药；HepG2／ADM和HepG2细胞的蛋白质点在双向电泳图谱上的分布模式基本一致；识别了45个在两株细胞之间差异表达的蛋白质点，HepG2／ADM细胞有25个蛋白点表达上调，9个蛋白点表达下调，7个蛋白点在HepG2／ADM细胞特异表达，4个蛋白点在HepG2细胞特异表达。结论本研究初步建立了分辨率较高、重复性较好的HepG2／ADM和HepG2细胞总蛋白质双向电泳图谱，两者之间存在一些差异表达蛋白，为进一步使用蛋白质组学方法研究肝癌多药耐药奠定了良好基础。     

人胆汁蛋白质组双向荧光差异凝胶电泳图谱的建立与差异分析

目的 建立人胆汁蛋白质组双向荧光差异凝胶电泳分析流程用于胆汁比较蛋白质组学研究.方法 实验组与对照组样本各6例,分别取自于胆管癌及胆总管结石病例.样本经纯化处理及定量后,分别标记不同的荧光染料后进行双向电泳与差异分析.结果 两组样本均获得高分辨力的双向电泳图谱;各标记蛋白质点的荧光强度与蛋白表达量呈线性关系;实验组与对照组间共筛选出55个差异表达蛋白,其表达量两组间相差1.5倍以上,t检验有统计学意义(P＜0.05).结论 建立了基于双向荧光差异凝胶电泳基础上的胆汁比较蛋白质组学的分析流程.     

胆囊黏膜ABCA1的表达和胆囊胆固醇息肉发病关系的研究

目的：研究ABCA1在胆囊黏膜的表达及其表达与胆囊胆固醇息肉发病的关系。方法：收集因胆囊疾患而行腹腔镜胆囊切除术病人的胆石、胆汁、胆囊黏膜及胆囊壁全层组织共计42例,其中胆囊胆固醇息肉15例,胆囊胆固醇结石15例,对照组12例（胆囊腺瘤5例,非胆固醇胆囊结石7例）。分别测定胆石胆固醇含量、胆汁胆固醇、胆汁酸、磷脂的浓度;实时PCR定量检测胆囊黏膜ABCA1、LXRα、RXRα的mRNA表达：胆囊壁全层组织做病理切片;免疫组化显示ABCAl蛋白在胆囊黏膜的表达．结果：胆固醇息肉组胆汁胆固醇饱和指数为1．0±0．2,较对照组胆固醇饱和指数0．6±0．3明显增高,其差别有统计学显著性（P〈0．01）。免疫组化显示ABCA1在胆囊黏膜上皮细胞有明显表达。息肉组、结石组和对照组胆囊黏膜ABCAI、LXRa、RXRα mRNA相对表达量比较,各组之间差异无统计学意义。结论：胆囊黏膜ABCA1的表达可能并不是导致胆囊胆固醇息肉发病的重要原因。     

腹腔镜胆囊部分切除术在保胆中的应用

目的：探讨完全腹腔镜下胆囊部分切除术在保胆中的应用价值。方法自2008年4月至2013年9月对63例胆囊畸形的患者行腹腔镜联合胆道镜胆囊部分切除术。将胆囊畸形分为胆囊萎缩和折叠畸形两种,病变部位皆位于胆囊的远端,慢性炎症明显。其中胆囊萎缩21例,呈葫芦状;占胆囊1/4者11例,1/3者10例。折叠畸形42例,畸形与体部成角≥90度,或虽畸形与体部成角≤90度,但折叠处及其远端慢性炎症明显;占胆囊1/4者7例,其中向左折叠畸形3例,向右折叠畸形4例;1/3者15例,均向右折叠畸形;1/2者15例,向左折叠畸形1例,向右折叠畸形14例;2/3者5例,向左折叠畸形1例,向右折叠畸形4例。保留的胆囊功能正常：胆囊管通畅,胆囊壁≤3 mm,无明显炎症,胆囊收缩试验≥30%。本组合并胆囊结石57例,占90.5%,30例是黑色胆色素及以胆色素为主的混合性结石,占52.6%。27例是胆固醇及以胆固醇为主的混合性结石,占47.4%。切除有病变的胆囊后,胆道镜检查取净结石,4-0可吸收线连续两层缝合胆囊。结果63例手术均获成功,手术时间90-180（134.7±24.1）min;排气时间分别是18-30（25.3±3.7） h;胆漏3例,每日5-30 ml,术后4、6、10 d 拔除引流管,术后7-11 d痊愈出院。所有患者均获随访,随访时间3-65个月,患者术前临床症状消失,无胆囊切除术后腹痛、脂肪泻等并发症的临床表现,无结石复发;术后6-12月胆囊代偿性扩张,最小达4 cm ×2.5 cm ×2.5 cm,术后胆囊收缩试验57%±12%,较术前42%±12%明显提高（t =17.12; P＜0.001）。结论完全腹腔镜结合胆道镜胆囊部分切除术保胆治疗胆囊疾病,对保护胆囊及胆囊功能具有重要的意义,是一种新的保胆术式。     

死精子症精子相关蛋白的蛋白质组学研究

目的:运用双向电泳(2-DE)和质谱技术比较1例死精子症患者和正常人精子的蛋白质组成差异。方法:用2-DE分离了10例正常生育者30份精子标本和1例死精子症3份精子标本的蛋白质,分别获得其参考图谱并进行比较,用质谱技术鉴定其中部分差异蛋白点。结果:在正常精子图谱和死精子症患者精子图谱分别分离出(905±57)和(792±28)个蛋白质点,死精子症患者精子图谱上有178个点未能匹配。对其中6个在患者图谱中缺失的蛋白质点进行了鉴定。结论:死精子症患者图谱上缺失的6个蛋白,可能与死精子症的形成有关。     

Primary establishment of human uterine muscle proteomic profiling by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry

Objective:To establish the protein profiling of human uterine muscle by two-dimensional electrophoresis.Methods:Five patients who underwent trans-abdominal hysterectomy due to cervical carcinoma in situ were in-cluded in this study.Postoperative uterine muscles were normal histologically.The total protein extracts from uter-ine muscle were separated using two-dimensional electrophoresis(2DE).Protein spots were stained by silver and de-tected by image analysis software.Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and peptide mass fingerprint(PMF)were used to identify the selected protein spots.Results:Well-resolved,reproducible 2DE maps of human uterine muscle were obtained.Average protein spots were 468±52 and matching rate was 82.76%.Five protein spots were successfully identified by mass spectrome-try.Conclusions:2DE coupled with MALDI-TOF-MS and PMF is a useful approach for establishing human uterine muscle proteomic profiling.This data will be useful for establishing human uterine muscle proteome database.