整合素阻断剂AP25单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备整合素阻断剂AP25的单克隆抗体,鉴定其效价和特异性.方法 从抗原免疫BALB/c小鼠分离免疫脾细胞,通过杂交瘤技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株并进行扩大培养.采用小鼠体内诱生法制备腹水,进行纯化后得到抗AP25单克隆抗体,用ELISA和Western blot鉴定其效价和特异性.结果 ELISA检测抗AP25单克隆抗体效价可达1∶2×106,Western blot鉴定抗体特异性良好.结论 获得了能够高表达抗AP25单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水制备抗体,纯化后得到效价高、特异性良好的AP25单克隆抗体.     

抗delta-like-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗delta-like-1的单克隆抗体并鉴定其特异性.方法 用delta-like-1多肽-BSA蛋白复合物作为免疫原免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经多次筛选及克隆化,建立可以稳定分泌抗delta-like-1单抗的杂交瘤细胞株.用ELISA、Western blot、细胞免疫组化对此抗体特性进行鉴定.结果 筛选到两株能稳定分泌抗delta-like-1单抗的细胞株3H11C11A9E3和2D5D11F8F1,亚类鉴定两株均为IgG1,轻链为kappa链;ELISA法测定两株细胞腹水抗体效价分别为1∶4.096×105和1∶1.024×105,抗体亲和常数分别为3.98×107、3.28 × 107L·mol-1;Western blot显示此单抗能特异性识别神经胶质瘤细胞株U251中的天然delta-like-1蛋白;细胞免疫组化进一步显示delta-like-1分布于细胞核中.结论 成功制备了抗delta-like-1单克隆抗体,可为研究delta-like-1与脑胶质瘤等神经系统疾病的关系奠定基础.     

2型猪链球菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogen-ase,GDH）的单克隆抗体。方法分别以2型S.suis全菌细胞和重组GDH蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株并克隆化;免疫印迹（Western blot）鉴定GDH单克隆抗体的特异性;制备小鼠腹水并进行抗体效价测定。结果细胞融合后经ELISA筛选获得分泌的阳性细胞株,经过有限稀释克隆化筛选,获得4株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单抗腹水的抗体效价均在1∶102400以上。结论本研究获得了4株能稳定分泌抗体且其分泌的抗体能够与GDH蛋白进行特异性反应的单克隆抗体细胞株,所获得特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,也能够进一步用于猪链球菌感染血清学诊断方法研究。     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体,鉴定其特性,为进一步研制HIV治疗性抗体提供贮备。方法将HIV-1 gp120基因片段连接到经酶切的原核表达载体PEGX-4T-2中,利用大肠杆菌XL1-blue表达GST-HIV蛋白。表达的蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆。重组免疫印迹分析(RIBA)和Western blot检测抗体特异性。结果构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1 gp120抗原基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE可见1条相对分子质量(Mr)32 000的表达蛋白条带。获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清效价为10-3,小鼠腹水效价为10-5,抗体亚型均为IgG1。RIBA结果显示6株单抗皆只与HIV-1 gp120抗原反应。Western blot结果显示在Mr32 000处可见1条单一目的条带。结论获得6株稳定分泌抗HIV-1 gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定了基础。     

相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定

目的制备相思子毒素单克隆抗体并鉴定其特性。方法以甲醛处理的相思子毒素毒蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果获得了4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞2D3、4E6、1C8和1E5,诱生的腹水效价分别为1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106,亚类鉴定表明2D3为IgG1,其余3株均为IgG2b;特异性鉴定显示它们与多种毒素均无交叉反应,经过亲和层析,获得了纯化的单抗。结论获得了特异性的相思子毒素单克隆抗体,为建立相思子毒素的检测及纯化方法奠定了基础,其中4E6的效价最高,可作为检测相思子毒素的核心试剂。     

抗人CDC7单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人CDC7蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性.方法 以GST-CDC7为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)融合,经多次筛选及克隆化,建立可以稳定分泌抗人CDC7单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用间接ELISA,Western Blot,免疫细胞化学(ICC)对此抗体特性进行鉴定.结果 筛选到1株能稳定分泌抗人CDC7的细胞株1F7D2C9.亚类鉴定为IgG2a,轻链为kappa链,ELISA法鉴定该抗体腹水效价为1∶102 400,抗体亲和常数为1.558×109 L/mol,Western Blotting分析表明,此抗体能特异识别细胞株的天然CDC7蛋白质.免疫细胞化学进一步显示CDC7分布于细胞核中.结论 成功制备了抗人CDC7单克隆抗体,为研究CDC7与细胞癌变的关系建立了基础.     

小鼠Metrnl单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗小鼠Metrnl单克隆抗体,并进行初步筛选鉴定。方法 分别制备小鼠Metrnl多肽片段和全长蛋白作为免疫小鼠抗原,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,并亚克隆获得稳定细胞株,制备腹水。用ELISA方法检测腹水抗体效价;用Western blot方法鉴定抗体。结果 由14种多肽抗原制备的56株单克隆抗体中,未筛选出可用于Western blot识别Metrnl的抗体;由全长蛋白制备的25株抗体中,有12株可识别Metrnl蛋白。结论 本实验成功制备了12株单抗,可用于识别检测小鼠Metrnl蛋白。     

抗紫杉醇单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗紫杉醇单克隆抗体并建立间接ELISA检测方法。方法:用琥珀酸酐法将紫杉醇(taxol)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制成全抗原taxol-BSA,采用紫外波长扫描法和薄层层析检测法对合成抗原进行鉴定;以taxol-BSA免疫Blab/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水。同时,对间接ELISA法反应条件进行了优化。结果:获得了3株能稳定分泌抗紫杉醇单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为taxol-A1,taxol-A2和taxol-A3;taxol-A3株腹水效价为1∶128 000,属于IgG2b亚型;建立的间接ELISA法检测条件为15μg.mL-1抗原、4℃包被过夜、1%BSA封闭1 h,PBS做抗体稀释液,单抗反应时间为30 min,酶标二抗作用时间1 h,10%浓硫酸终止反应。结论:获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法。本研究制备的抗紫杉醇单克隆抗体及建立的间接ELISA检测方法,为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础。     

抗人内皮细胞生长抑制素单克隆抗体的制备和鉴定

研制抗内皮细胞生长抑制素（Endostatin，ES）单克隆抗体，为ES制剂提供更有效的质量控制手段和为内皮细胞抑制素介入基因治疗肿瘤提供临床评价工具。将重组的人ES蛋白纯化，免疫BALB／c小鼠，取ES蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓细胞Ag8．653进行细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经3次有限稀释法亚克隆，获得4株鼠抗人ES蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为：1C2、6C4、6134、6C5，以间接ELISA、Western免疫印迹等方法进行抗体鉴定。结果表明4株杂交瘤细胞分泌的单抗具有效价高，特异性好的特点，且免疫球蛋白亚型均为IgG1。其中1C2亲和力强，具有较高的应用价值。所得单克隆体具有一定的特异性和敏感性，可为ES的深入研究提供更好的条件。     

单株抗人肝脏微粒体蛋白及细胞色素P450单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗正常人肝脏微粒体(HLM)及细胞色素P450蛋白的单克隆抗体.方法:采用人肝脏微粒体蛋白作为免疫原免疫Balb/C小鼠,按常规方法融合、克隆,经间接ELISA法筛选抗体阳性杂交瘤细胞株,通过单抗亚类、Western blot对抗体进行初步鉴定.结果:成功地制备了一株抗肝微粒体蛋白的单克隆抗体(MAb),命名为MAb 10C7.用鼠单抗亚类快速鉴定纸条鉴定10C7为IgG2b.Western blot分析显示,MAb 10C7可特异识别相对分子量为46kD的人肝脏微粒体蛋白.结论:MAb 10C7抗正常人肝脏微粒或细胞色素P450蛋白的特异性强,对相关蛋白质的功能研究有较好的应用前景.     

小鼠BMPR-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定的实验研究

目的制备小鼠骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)的单克隆抗体并鉴定其活性。方法以BMPR-Ⅱ为抗原免疫BalB/c小鼠,通过杂交瘤技术建立稳定分泌抗BMPR-Ⅱ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,克隆化培养后接种于小鼠腹腔制备BMPR-Ⅱ的单克隆抗体,通过间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光技术对其进行鉴定。结果获得一株能稳定分泌抗BMPR-Ⅱ单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为3F6,其腹水效价为105,亚类为IgG1;通过免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光证实制备的BMPR-Ⅱ抗体可与组织和细胞中的BMPR-Ⅱ蛋白特异性结合。结论本实验成功制备了可稳定分泌具有生物活性的BMPR-Ⅱ单克隆抗体的杂交瘤细胞及特异性的BMPR-Ⅱ单克隆抗体,可用于BMPR-Ⅱ免疫检测方法的初步应用。     

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定。方法用稳定表达B7-H4分子的L929/B7-H4转基因细胞免疫6-8周龄的Balb/c小鼠。取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,采用流式细胞术筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗B7-H4单克隆抗体的细胞株,并用Western blot和Dot blot鉴定其生物学特性。细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定T细胞增殖情况。结果成功获得1株稳定分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C8。Western blot和Dot blot结果表明,5C8能与人B7-H4蛋白特异性结合。CCK-8实验显示,5C8可以阻断B7-H4分子对T细胞增殖的抑制作用。结论成功获得鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为研究B7-H4分子在肿瘤中的作用提供了手段。     

Preparation and primary identification of mouse anti-human B7-H4 monoclonal antibody

目的 制备鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法 用稳定表达B7-H4分子的L929/B7-H4转基因细胞免疫6-8周龄的Balb/c小鼠.取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,采用流式细胞术筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗B7-H4单克隆抗体的细胞株,并用Western blot和Dot blot鉴定其生物学特性.细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定T细胞增殖情况.结果 成功获得1株稳定分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C8.Western blot 和Dot blot结果表明,5C8能与人B7-H4蛋白特异性结合.CCK-8实验显示,5C8可以阻断B7-H4 分子对T细胞增殖的抑制作用.结论 成功获得鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为研究B7-H4分子在肿瘤中的作用提供了手段.     

抗胃泌素释放肽单克隆抗体的制备及其在体外对乳腺癌细胞生长的抑制

研制抗胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide,GRP)单克隆抗体,并且初步评估其在体外对乳腺癌细胞生长的抑制作用。纯化重组的GRP融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,取经免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓细胞SP2/0进行细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经3次有限稀释法亚克隆,获得稳定分泌GRP抗体的杂交瘤细胞株,进一步从腹水中用硫酸铵沉淀法纯化单抗,并以间接ELISA、Western免疫印迹以及亚类分型等方法进行抗体鉴定,之后在体外用MTT比色法测定该单抗抑制乳腺癌细胞EMT-6生长的作用。结果表明通过筛选获得了一株阳性杂交瘤细胞,命名为W9,这株杂交瘤细胞分泌的单抗具有效价高,特异性好的特点,其亚型为IgG1,体外的细胞实验也表明这种单克隆抗体能够显著地抑制EMT-6细胞的增殖。     

抗汉城病毒荧光单克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗汉城病毒（Seoul virus,SEOV）荧光单克隆抗体（单抗）,并初步应用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液的病毒灭活验证。 方法  以SEOV L-99株灭活病毒原液为免疫原,采用小鼠杂交瘤细胞融合技术,筛选抗SEOV特异性单抗杂交瘤;小鼠体内诱生法制备单抗腹水,蛋白A亲和层析纯化单抗,并以蛋白质印迹法鉴定其特异性;间接ELISA测定单抗效价和相对亲和力;纯化单抗采用搅拌法标记异硫氰酸荧光素,并分别采用直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法对Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行病毒灭活验证。结果 共筛选出4株特异性抗SEOV L-99株杂交瘤1D5、2E3、3A4及5B7。蛋白质印迹法鉴定4株单抗均与SEOV L-99株核衣壳蛋白发生特异性反应;间接ELISA测定腹水效价为3.13×10^-8~ 1.25×10^-7;相对亲和力顺序为1D5>3A4>2E3>5B7;纯化抗体纯度>95%;异硫氰酸荧光素标记1D5株单抗的结合比率为3.4;直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法检测盲传3代的Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液,病毒灭活验证结果一致。结论 成功筛选到高效价特异性抗SEOV单抗,并制备成荧光单抗,可用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗生产工艺中的病毒灭活验证。     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

抗HBsAg的单克隆抗体用于HBsAg的自动化检测

作者用经亲和层析法纯化的HBsAg免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合。选得3株分泌抗-HBs的杂交瘤细胞。此3株细胞分泌的抗体具有HBsAg a决定簇特异性,均属小鼠IgGl亚类。其中一株杂交瘤细胞(K1/3/2)用被动血凝试验测得其细胞培养液中抗-HBs的血凝滴度为2×10~4,小鼠腹水中抗-HBs的血凝滴度为10~7。腹水抗体经(NH_4)_2SO_4沉淀,DEAE-Seph-     

小鼠HSP27/HSPB1单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备针对热休克蛋白27/热休克蛋白B1(HSP27/HSPB1)的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用HSP27/HSPB1作为免疫抗原免疫BalB/c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,进行克隆化培养后接种于小鼠腹腔制备HSP27/HSPB1单克隆抗体,并利用间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光技术对所制备的抗体进行鉴定。结果获得了一株可稳定分泌HSP27/HSPB1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为4C9C7,其亚类是IgG1,分泌的单克隆抗体能特异性结合组织和细胞中的HSP27/HSPB1蛋白。结论本实验成功制备了可稳定分泌HSP27/HSPB1单克隆抗体的杂交瘤细胞及HSP27/HSPB1特异性的单克隆抗体,可应用于各种相关的科学研究。     

丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：以基因工程表达的丙型肝炎病毒抗原蛋白（HCAg）为抗原，建立分泌单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系．并对其分泌的McAh进行鉴定。方法：用纯化HCV基因工程表达抗原（HCAg）免疫Balb／c小鼠，取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备McAb。采用ELISA及分片断鉴定技术进行鉴定。结果：筛选出5株能稳定分泌特异性抗-HC的McAb杂交瘤细胞株，经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体，特异性强，效价高。与不同抗原蛋白的ELISA反应呈特异性阳性反应。分片断鉴定结果显示，所获5株McAb主要为抗HCV核心蛋白和非结构蛋白NS3。结论：此5株丙肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丙肝抗原具有特异亲和性，为丙型肝炎病毒抗原诊断试剂的研制提供了关键技术基础。     

接头蛋白c-Crk 单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备接头蛋白c-Crk单克隆抗体。方法以c-Crk为抗原,免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌抗c-CrkmcAb的杂交瘤细胞,用ELISA,western-blot等鉴定其生物活性。结果获得两株能稳定分泌c-CrkmcAb的杂交瘤细胞（3C7、3G11）,亚类均为IgG1;腹水效价为1∶105;western-blot、免疫组织化学分析和ELISA检测证实两株mcAb均与c-Crk有较高的特异性。结论本实验成功制备了两株抗c-Crk特异性的mcAb,可用于c-Crk免疫检测方法的建立。