Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

miRNA219-5P靶向调控Smad4表达影响TGF-β_1诱导肌腱成纤维细胞纤维化的研究

目的探讨mi RNA219-5P(mi R219-5P)调控Smad4在TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞(tendon derived fibroblasts,TDFs)纤维化过程中的作用。方法取患者自愿捐赠的肌腱组织分离培养TDFs,取第3代细胞进行实验。化学合成mi R219-5P类似物(mimics)、阻遏物(inhibitor)及阴性对照序列,分别转染TDFs 48 h后,采用实时定量PCR及Western blot法分别检测mi R219-5P基因及Smad4蛋白表达情况;以正常细胞作为空白对照。信息学软件预测mi R219-5P与Smad4基因3’UTR区结合位点,构建Smad4预测基因3’UTR-PGL3重组质粒,构建野生型及突变型报告基因表达载体,并通过荧光素酶报告基因实验进行靶位验证。取正常及转染后TDFs,采用TGF-β1诱导细胞发生纤维化,于培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性变化,72 h时采用Western blot法检测纤维化相关蛋白指标。结果 mi R219-5P mimics转染TDFs可明显上调mi R219-5P表达、下调Smad4蛋白表达,而mi R219-5P inhibitor抑制细胞内mi R219-5P表达、增加Smad4蛋白表达,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。荧光素酶实验显示,与p GL3-WT-Smad4转染组比较,p GL3-WT-Smad4+mimics转染组细胞内荧光素酶活性降低、p GL3-WT-Smad4+inhibitor转染组活性增强(P0.05);而p GL3-MT-Smad4+mimics转染组、p GL3-MT-Smad4+inhibitor转染组组间比较无明显变化(P0.05)。与空白对照组比较,TGF-β_(1)诱导培养72 h后细胞增殖活性明显增强(P0.01),同时上调细胞纤维化相关蛋白指标的表达(P0.01);与直接诱导组比较,mi R219-5P过表达且诱导组TDFs细胞增殖活性和纤维化蛋白指标升高趋势得到抑制,而mi R219-5P表达抑制且诱导组细胞增殖活性和纤维化蛋白指标则进一步增强,差异有统计学意义(P0.01)。结论 mi R219-5P可通过抑制其靶基因Smad4表达,显著抑制TGF-β_(1)诱导TDFs纤维化。     

miR-200c通过AKT2对骨肉瘤细胞增殖的影响

[目的]探讨过表达mi R-200c通过对AKT2的相关调控对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的依据。[方法](1)检测mi R-200c在正常成骨细胞和4种骨肉瘤细胞株中的表达差异;(2)将mi R-200c转染至骨肉瘤细胞株MG-63中,构建稳定过表达mi R-200c骨肉瘤细胞株;(3)预测mi R-200c与AKT2基因的相关结合位点,构建相应的荧光素酶基因表达载体,连同过表达mi R-200c质粒共转染至骨肉瘤细胞株MG-63中;(4)检测两组骨肉瘤细胞株MG-63荧光素酶活性;(5)检测两组骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2表达水平;(6)观察两组骨肉瘤细胞株MG-63的增殖能力。[结果](1)与正常成骨细胞(NHOst)相比,mi R-200c在4种骨肉瘤细胞株(HOS、U2OS、Saos-2、MG-63)中表达量明显降低(P0.05);(2)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c组骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2 3′-UTR序列结构野生型(WT)的荧光素酶活性明显降低(P0.05),而突变型(MUT)的荧光素酶活性无明显差异(P0.05);(3)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c的骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2表达明显降低(P0.05);(4)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c骨肉瘤细胞株MG-63增殖能力明显下降(P0.05)。[结论]mi R-200c在骨肉瘤细胞中低表达,而过表达mi R-200c通过靶向调控AKT2表达抑制骨肉瘤细胞的增殖。因此mi R-200c可能对未来骨肉瘤的预防及治疗提供新的策略。     

NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响

[目的]观察NF-kB抑制剂PDTC对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡及Livin和Caspase-9表达的影响.[方法]体外培养人骨肉瘤MG -63细胞系,用50,100,200和400 RmoV L的PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24,48,72 h后,用MTT法测各组骨肉瘤MG-63细胞存活率,用流式细胞仪测细胞的凋亡率.用Western Blot方法检测不同浓度PDTC作用于骨肉瘤MG-63细胞24 h后,各组细胞的Livin和Caspase-9蛋白的表达水平.[结果]随PDTC浓度增加,骨肉瘤MG-63细胞后其增殖活性呈下降趋势,作用时间越长细胞的增殖活性越低,而细胞的凋亡率呈上升趋势(P<0.05).随PDTC浓度增加各组细胞中Livin蛋白的表达呈下降趋势,而Caspase9蛋白表达呈上升趋势(P<0.05).[结论]PDTC可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与PDTC抑制NF-kB传导通路,下调Livin表达继而上调Caspase-9表达有关.     

Notch1 siRNA对乏氧环境骨肉瘤细胞MG-63增殖及周期的影响

[目的]探讨Notch1 siRNA对乏氧环境人骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和周期的影响。[方法]将骨肉瘤细胞株MG-63细胞置于乏氧(37℃、1%O2、5%CO2)环境下培养作为实验组,以正常氧环境(37℃、21%O2、5%CO2)下培养作为对照组,培养72 h,应用MTT方法检测不同时间乏氧培养对MG-63细胞增殖的影响;采用Notch siRNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,MTT方法检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达变化。[结果]乏氧培养可促进MG-63细胞增殖,48 h常氧及乏氧对细胞增殖的作用可见明显差异(2.164±0.075 vs 1.421±0.086)(P<0.01)。流式细胞分析显示实验组、对照组MG-63细胞培养48 h G1/G2期细胞比例分别为(41.79±3.25)%和(53.87±2.31)%(P<0.05),乏氧可以促进细胞周期进展,Notch1 siRNA有效下调乏氧MG-63细胞Notch1蛋白表达,Notchl siRNA作用48 h后乏氧环境MG-63细胞周期阻滞于G1/G2期。Western-blot结果显示乏氧环境下MG-63细胞HIF-1a、Notch1蛋白表达增高。[结论]乏氧环境能通过促进MG-63细胞周期进展,从而明显促进细胞增殖,阻断Notch可逆转乏氧对MG-63细胞促增殖作用,提示Notchl是治疗骨肉瘤的有效分子靶点。     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

miR-100对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

[目的]观察miR-100对不同骨肉瘤细胞系的表达差异,研究miR-100对骨肉瘤细胞MG-63增殖、侵袭迁移能力的影响。[方法]采用qRT-PCR检测miR-100在骨肉瘤细胞系中的表达差异。通过脂质体2000转染说明对骨肉瘤细胞MG-63进行转染操作,分别构建miR-100过表达和miR-100阴性对照组。转染骨肉瘤成功后,通过CCK-8实验检测miR-100对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,同时Transwell实验检测骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力变化。[结果]miR-100在骨肉瘤细胞系中表达差异显著(P0.05),且差异具有统计学意义;相比miR-100NC组,过表达miR-100增殖、侵袭、迁移能力明显下降(P0.05),且差异具有统计学意义。[结论]miR-100在骨肉瘤中呈现低表达;过表达miR-100抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力。miR-100可能会成为未来骨肉瘤治疗的潜在靶点。     

阻断转化生长因子β1自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响

[目的]观察阻断转化生长因子β1(TGFβ1)自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响。[方法]将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG-63,G418筛选14d后获得转染细胞系MG-TGFβ1(-)。取MTT法检测转染细胞增殖活性,并观察细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。[结果]与MG-63和空载体转染细胞MG-pcDNA3相比,MG-TGFβ1(-)细胞增殖活性明显受到抑制。MG-TGFβ1(-)的软琼脂克隆形成数(28·2±5·6)比MG-63组(48·6±8·1)和MG-pcDNA3组(45·2±4·7)明显减少,裸鼠体内形成肿瘤的体积(83·4±27·4)mm3也明显小于MG-63组(191·3±21·5)mm3和MG-pcDNA3组(204·2±30·7)mm3。[结论]反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞可以逆转肿瘤细胞的恶性表型,进一步的研究将有助于提高骨肉瘤的治疗效果。     

Survivin-siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株增殖抑制的影响

我们应用化学合成的特异性Survivis-siRNA在脂质体的介导下转染骨肉瘤MG-63细胞，观察其对骨肉瘤细胞增殖抑制的影响。[第一段]     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

miR-137靶向作用RUNX2调控MC3T3-E1细胞成骨分化

目的探讨miR-137对RUNX2的靶向作用及其对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法通过软件预测miR-137与成骨标志基因RUNX2的结合位点。检测MC3T3-E1细胞诱导成骨分化过程中miR-137的表达变化。转染miR-137 mimics或miR-137 inhibitor后,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,检测成骨分化标志物(RUNX2、ALP、OPN、OCN及OSX)表达变化。结果经软件预测,miR-137与靶基因RUNX2有结合位点。MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,miR-137表达下调。转染miR-137mimics的MC3T3-E1细胞成骨标志基因表达受到抑制,而转染miR-137 inhibitor组成骨标志基因呈不同程度表达上调。结论miR-137通过靶向作用RUNX2基因调控MC3T3-E1细胞成骨分化。     

葛根素对成骨细胞中miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

目的研究葛根素作用于成骨细胞MC3T3-E1后miRNA表达的变化以及与Runx2基因表达的关系。方法 RT-PCR和western blot法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平;miRNA表达谱检测葛根素作用于成骨细胞后可能靶向Runx2的miRNA;Target Scan、Pic Tar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA;RT-PCR测定miRNA-204表达量;构建Runx23’UTR/突变型Runx2 3’UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;miRNA-204mimics和miRNA-204inhibitor转染MC3T3-E1细胞,RT-PCR和western blot检测转染前后Runx2的mRNA表达量和蛋白表达量的变化。结果与空白组比较葛根素作用后Runx2的miRNA和蛋白表达均上升;miRNA-204表达水平下降;表达谱和靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miR-3072-3p等;过表达miRNA-204后Runx2的蛋白表达水平下降,干扰miRNA-204表达后Runx2的蛋白水平上升。结论葛根素在成骨细胞中可通过调节靶向Runx2基因的miRNA-204来促进细胞增值分化。     

乏氧与Notch通路在骨肉瘤表达及耐药作用的研究

[目的]检测乏氧和Notch通路相关蛋白在人骨肉瘤标本组织中的表达情况,并采用MG-63细胞实验研究多种相关蛋白参与骨肉瘤化疗的耐药机制。[方法]免疫组织化学方法检测HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白在骨肉瘤及骨软骨瘤临床标本组织中表达情况。采用Notch si RNA转染乏氧环境中的MG-63细胞,Western blot检测相关蛋白表达情况,MTT方法检测细胞化疗药物敏感性的影响。[结果]骨肉瘤组织中HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白的阳性表达率均显著高于骨软骨瘤组织,差异有统计学意义(P0.05)。HIF-1α与Notch1之间,Notch1与MRP1之间,以及HIF-1α与MRP1之间存在显著正相关(P0.05),而MDR1/P-gp与其他三种蛋白表达无相关性(P0.05)。乏氧状态下MG-63细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的半数抑制浓度IC50显著高于常氧状态,差异有统计学意义(P0.05)。而乏氧环境Notch1 si RNA转染的MG-63细胞对顺铂、阿霉素、甲氨蝶呤或异环磷酰胺的半数抑制浓度IC50显著降低,差异有统计学意义(P0.05),且Notch1-ICN和MRP1蛋白表达水平明显降低。[结论]骨肉瘤组织中HIF-1α、Notch1、MDR1/P-gp、MRP1蛋白的阳性表达率高于骨软骨瘤。乏氧条件下MG-63细胞对多种化疗药物呈耐药性,阻断Notch1可逆转乏氧诱导的骨肉瘤细胞多药耐药,提示Notch1是治疗骨肉瘤耐药的有效分子靶点。     

微小RNA-146a在骨肉瘤中的表达及意义

目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-146a在骨肉瘤中表达的意义和miRNA-146a对骨肉瘤的作用机制.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测骨肉瘤标本和癌旁组织中miRNA-146a表达量,并采用Cox回归模型分析其与患者生存期的相关性.质粒转染miRNA-146a进入骨肉瘤细胞TE85中,检测转染后细胞活性、细胞凋亡和细胞中YY1、Fas蛋白的表达.结果 癌旁组织和骨肉瘤组织中miRNA-146a的表达量分别为1.213±0.525和0.734±0.263,差异有统计学意义(P＜0.05).miRNA-146a的表达量与患者的生存时间呈正相关(P＜0.05).转染miRNA-146a24 h后,50、100 nmol/L组人骨肉瘤细胞活性明显降低至(65.161±5.528)％和(40.385±8.442)％(P＜0.05),细胞凋亡率分别明显升高至(38.671±12.415)％和(59.513±9.058)％ (P＜0.05),细胞中YY1蛋白表达量明显降低(分别为0.472±0.014和0.272±0.005,P＜0.05),而Fas蛋白表达量明显升高(0.292±0.010、0.584±0.006,P＜0.05).转染miRNA-146a 48 h后,与对照组比较,50、100 nmol/L组人骨肉瘤细胞活性、凋亡率、YY1表达量和Fas蛋白表达量变化与转染24 h的变化相似.结论 miRNA-146a对骨肉瘤的作用是通过下调YY1的表达,而上调Fas蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖同时促进骨肉瘤细胞的凋亡.     

鹰嘴豆芽素A诱导人成骨肉瘤MG63细胞凋亡作用研究

[目的]探讨植物雌激素(phytoestrogen)鹰嘴豆芽素A (biochanin-A, BA)诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-altivated protein kinase, MAPK)/凋亡信号通路的作用机制。[方法]用不同浓度的鹰嘴豆芽素A处理MG-63细胞,以MTT法检测细胞活性的抑制情况;以DAPI染色法和Annexin-V/PI流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;应用Western blot法检测MG-63细胞中MAPK信号通路相关蛋白磷酸化和主要凋亡通路Bcl-2家族和caspase家族相关蛋白的表达情况。[结果] BA有效抑制MG-63细胞的细胞活性,并呈时间和剂量依赖效应,且可以诱导细胞凋亡。40μmol/L和80μmol/L的BA作用于MG-63细胞48 h,细胞凋亡率分别为(45.28±3.79)%和(82.51±5.23)%,高于正常组(5.31±3.14)%(P0.05)。Western blot结果显示,BA可促进caspase-9、caspase-3和PARP发生剪切(P0.05),并促进p-p38、p-JNK、Bax的表达(P0.05),抑制Bcl-2的表达(P0.05),并呈剂量依赖效应。[结论]鹰嘴豆芽素A可有效抑制人成骨肉瘤MG-63细胞的细胞活性,促进细胞凋亡,作用机制可能是通过激活MAPK/凋亡信号通路来实现。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的影响

[目的]研究反义c-myc寡核苷酸(c-mycASODN)对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响。[方法]设计c-mycASODN片段,将其转入人骨肉瘤MG-63细胞,通过HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪(FCM)分析,观察和分析其对瘤细胞凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白表达的影响。[结果]形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实反义c-myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞从G1期进入S期,即产生G1/S期阻滞,出现明显的凋亡峰,凋亡率达36.82%,并可抑制c-myc基因蛋白的表达。[结论]反义c-myc寡核苷酸可明显诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

反义表达人组织蛋白酶L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响

目的: 构建人组织蛋白酶L (cathepsinL, CATL) 基因的正、反义真核表达载体, 观察其转染后对人骨肉瘤细胞MG-63侵袭特性的影响。方法: 用基因重组技术构建人组织蛋白酶L正、反义真核表达载体, 转染人骨肉瘤细胞MG-63, RT-PCR和Westernblot检测CATL的mRNA和蛋白质的表达水平, 并对转染前后骨肉瘤细胞的侵袭能力进行检测。结果: 正、反义真核表达载体成功构建并转染入MG-63细胞中。反义载体转染后的细胞CATL的mRNA和蛋白质的表达水平下降, 体外侵袭实验表明细胞的侵袭力下降。结论: 反义CATL基因的转染使骨肉瘤细胞CATL的分泌水平下降, 细胞的体外侵袭力下降。     

塞来昔布协同顺铂P13K/Akt途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 塞来昔布(50 μmol/L或100 μmol/L)和(或)顺铂(10 μg/ml)作用骨肉瘤MG-63细胞48 h后,MTT法测定细胞增殖的抑制率,电子显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测基因水平COX-2表达变化,Western blot检测COX-2及凋亡相关蛋白表达变化.P13K抑制剂Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测蛋白表达变化.结果 塞来昔布导致MG-63细胞阻滞在G1期,通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡;顺铂单药作用后骨肉瘤MG-63细胞凋亡率为5.93%,而联合应用塞来昔布50μmol/L或100 μmol/L后,凋亡率分别为6.66%和37.15%,与顺铂联合具有明显的协同作用;COX-2蛋白表达未降低.塞来昔布联合顺铂明显降低P13K/Akt、survivin、Bcl-2的表达,检测到caspase-9、caspase-3的激活和PARP裂解片段.Wortmannin作用MG-63细胞48 h,检测到pAkt(Thr308)、Bcl-2、survivin表达下调.结论 塞来昔布可通过非COX-2途径诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡,与P13K/Akt、survivin、Bcl-2蛋白相关,并且PI3K/Akt途径在survivin、Bcl-2表达调控中发挥重要作用.这可能是塞来昔布药物干预的中心环节.