马尔尼菲青霉菌培养与鉴定

目的 提高马尔尼菲青霉菌(PMA)培养鉴定在基层实验室的诊断水平.方法 取患者血液或骨髓液置于BacT/Alert 3D血培养仪系统配套的成人中和抗生素培养瓶,经培养提示阳性,取阳性培养物和淋巴结组织涂片、革兰染色镜检见病原体有细长分枝、分隔菌丝、腊肠形菌体,转种到哥伦比亚血平板、萨布罗琼脂及CHROMagar假丝酵母菌显色培养基,观察25℃和35℃孵育时的菌落形态及镜下菌体特征;测试相关生化反应,观察其结果.结果 PMA培养鉴别依据:是双相型真菌,25℃培养为真菌相,35℃培养为酵母相,均能产生葡萄酒红色色素;显微镜下菌体形态:25℃培养有典型的帚状枝,35℃培养可见圆形、卵圆形、两端钝圆略弯曲呈腊肠形有横隔菌体;生化结果:都能同化和发酵葡萄糖产酸,脲素酶阳性,都能被放线菌酮环己酰亚胺抑制,不能同化发酵乳糖.结论 PMA适宜的培养基是萨布罗培养基,菌体形态结构适宜的染色是乳酸棉兰染色、革兰染色,适宜基层实验窀开展.     

马尔尼菲青霉菌的分子生物学研究进展

马尔尼菲青霉菌是东南亚国家和我国南方地区艾滋病机会性感染常见的侵袭性真菌,一般引起播散性感染.其感染确诊需要病原诊断,治疗难度较大,病死率高.该菌致病途径多样,发病机制复杂,与流行病学、基因组学、蛋白组学等因素相关.近年来,马尔尼菲青霉菌分子流行病学特点、基因组特征、致病与耐药分子机制及PCR快速诊断等方面的研究取得了初步进展,为有效防治艾滋病合并马尔尼菲青霉菌感染提供了可靠的理论依据.     

马尔尼菲青霉菌DNA检测及序列分析

目的设计马尔尼菲青霉菌种特异性引物,探讨马尔尼菲青霉病早期诊断的方法. 方法采用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增我科保存的2株和广西医科大学附一院惠赠的1株马尔尼菲青霉菌rDNA ITS,扩增产物纯化后直接测序,测序结果在国际基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索、比对、分析. 结果 3株临床分离的马尔尼菲青霉菌rDNA ITS序列相同;与来源于美国、印度尼西亚、法国、澳大利亚的马尔尼菲青霉菌的rDNA ITS序列一致;马尔尼菲青霉菌与荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、念珠菌以及曲霉和青霉属间的rDNA ITS序列差异较大,而青霉种间的rDNA ITS序列差异不大. 结论不同来源的马尔尼菲青霉菌种间的rDNA ITS序列具有高度的同源性;提示该区不适合作为靶基因来设计该菌的种特异性引物或探针,应考虑在别的区域继续寻找.     

马尔尼菲青霉菌致病机制的研究进展

马尔尼菲青霉菌是艾滋病患者常见的机会性致病菌,其致病性与自身毒力因子、致病基因及宿主免疫等有关。随着全基因组测序的完成,基于基因组学和蛋白质组学的新技术不断运用于马尔尼菲青霉菌的致病性研究中。此文就目前马尔尼菲青霉菌致病机制的研究进展进行综述。     

马尔尼菲青霉菌鉴定要点及该菌酵母相体外药敏分析

目的了解马尔尼菲青霉菌(PM)鉴定要点及该菌酵母相体外药敏结果,以指导临床合理用药。方法收集某院2009—2016年23例PM感染患者血或骨髓的分离株,观察其菌落形态,采用E-test法分析酵母相PM对伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑的药物敏感性。结果 PM形态:组织标本瑞氏染色直接镜检,可见典型卵圆形或圆形有明显横隔的孢子,常位于巨噬细胞内;血培养标本革兰染色镜检,可见菌体两端钝圆略弯曲呈腊肠样,偶有分枝状,可见有横隔。PM为双相型真菌,28°C为菌丝相,产生红色色素扩散入培养基中;35°C为酵母相,并有各自典型的菌落形态特征。伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑对酵母相(35°C)PM的最低抑菌浓度(MIC)范围分别为0.002~0.016、0.012~0.125、0.002~0.500、0.500~16.000μg/m L。结论 PM的特征性菌落形态,以及骨髓和外周血发现的真菌孢子对该菌有诊断价值。该菌对伊曲康唑敏感性最强,其次是伏立康唑、两性霉素B,而氟康唑敏感性相对较弱。     

脑脊液检出马尔尼菲青霉菌的方法探讨

目的探讨脑脊液检测马尔尼菲青霉菌方法。方法脑脊液利用真菌培养瓶延长培养10 d左右出现阳性报警,经直接涂片(湿片和革兰染色),分离培养,体外双相形态转换确定霉菌相和酵母相,以及钢圈小培养等初步确定是马尔尼菲青霉菌,最后经测序鉴定是马尔尼菲青霉菌;同时脑脊液离心沉渣常规涂片后革兰/瑞士染色均检到马尔尼菲青霉菌孢子。脑脊液多次进行总蛋白、腺苷酸脱氢酶(ADA)和葡萄糖等生化检测。结果脑脊液真菌延长培养和脑脊液常规涂片均可检到马尔尼菲青霉菌。脑脊液生化检测指标有相应提示。结论在正常人体中,马尔尼菲青霉菌感染是潜伏性发作,出现各种临床表现,常常会误诊,导致高死亡率。侵犯中枢神经系统更是少见,所以脑脊液检出马尔尼菲青霉菌需要多部门多方法共同协作,尽早明确诊断,及时抗真菌治疗,提高生存率。     

儿童马尔尼菲青霉菌感染的鉴定方法研究

目的设计马尔尼菲青霉菌（PM）种特异性引物,采用荧光定量PCR的方法,并结合传统的形态学检查,以达到可以在临床实验室进行快速诊断的目的。方法取患儿血液、骨髓进行真菌双相培养,观察真菌生长情况及菌落形态,显微镜下观察菌体特征,并将培养物涂片进行一系列染色。针对PM5．8SrRNA设计特异性PCR引物,采用核酸荧光染料SYBRGreenI进行实时荧光定量PCR检测。结果PM为双相性真菌,于25℃为青霉相,于37℃为酵母相,并均有典型的菌落形态特征。染色可见菌体根据染色方法不同、形态不同呈现不同特征。荧光定量PCR方法的特异性较好,与该菌属内的其他细菌间无交叉反应。结论PM的特征性菌落形态对该菌有诊断价值,对该菌进行某些简单的染色可作为快速诊断与鉴别该菌的主要辅助手段,而实时荧光定量PCR方法在检测PM中的应用可以大大缩短临床的诊断时间,提高临床诊断的准确度和效率。     

儿童马尔尼菲青霉病分析

目的 了解儿童马尔尼菲青霉病的临床表现及实验室诊断特点.方法 对3例马尔尼菲青霉病患儿的临床资料和实验室检查进行分析.结果 马尔尼菲青霉菌常首先在血液或骨髓中检出.真菌检查可见明显特征:涂片镜下可见细胞内外有腊肠样菌体,部分有横隔;真菌培养表现为双相菌,25℃为真菌相,底部产生特征性红色素,35℃为酵母相,无色素,有酵母样菌体.结论 儿童马尔尼菲青霉菌感染主要因免疫功能不完善引起,容易误诊和漏诊,预后凶险,应加强认识,早期诊断、及时治疗有利于取得良好的预后.     

儿童马尔尼菲青霉病分析

目的了解儿童马尔尼菲青霉病的临床表现及实验室诊断特点。方法对3例马尔尼菲青霉病患儿的临床资料和实验室检查进行分析。结果马尔尼菲青霉菌常首先在血液或骨髓中检出。真菌检查可见明显特征：涂片镜下可见细胞内外有腊肠样菌体，部分有横隔；真菌培养表现为双相菌，25℃为真菌相，底部产生特征性红色素，35℃为酵母相，无色素，有酵母样菌体。结论儿童马尔尼菲青霉菌感染主要因免疫功能不完善引起，容易误诊和漏诊，预后凶险，应加强认识，早期诊断、及时治疗有利于取得良好的预后。     

艾滋病并发马尔尼菲青霉病的真菌培养与鉴定

目的：明确并检出继发于艾滋病的马尔尼菲青霉病的病原体马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei,PM）。方法：取患者骨髓、血液、皮损分泌物等接种于沙保弱培养基上，分别于25℃和37℃孵育，观察PM生长情况及菌落形态，并涂片、固定、染色，显微镜下观察菌体特征。结果：PM为双相性真菌，于25℃为青霉相，产生具有特征性的红色可溶性色素弥散于基质中，镜下可见典型的帚状枝；37℃为酵母相，无色素产生，镜下可见酵母样孢子，形似腊肠。本菌株与国际标准株ATCC24100扩增片段相同。结论：马尔尼菲青霉病诊断的金标准是从患者体内分离出PM，关注艾滋病与马尔尼菲青霉病的相关性，对及时确诊艾滋病具有重要意义。     

马尔尼菲青霉菌感染临床分析

目的 目的探讨马尔尼菲青霉菌病(PSM)的流行病学及临床特点.方法 回顾性分析2007年1月-2011年12月医院收治的54例确诊为马尔尼菲青霉菌(PM)感染患者的临床资料.结果 54例PSM患者基础疾病分别为46例HIV感染、4例肾脏疾病、3例淋巴系统疾病、1例系统性红斑狼疮;2007-2011年医院198 286例患者送检的标本中旱季检出HIV感染332例,合并PM感染13例,阳性率3.91％,雨季检出358例,合并PM感染33例,阳性率9.22％,HIV感染无季节性,差异无统计学意义,但HIV感染合并PSM在雨季与旱季相比,差异有统计学意义(P＜0.01);PM感染呈多部位播散感染,临床表现有发热、贫血、肝脾肿大、浅表淋巴结肿大、皮疹等症状.结论 PM是广西地区HIV感染患者主要条件致病菌之一;PSM发病有明显季节性,以雨季为主;PSM临床表现无特异性,临床应注重对患者标本的培养,做到早诊断、早治疗.     

环介导等温扩增技术检测马尔尼菲青霉菌的研究

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立马尔尼菲青霉菌(PM)快速检测方法,探讨该方法的特异性、敏感性等,评价其临床应用价值。方法针对马尔尼菲青霉菌的特异性基因MP1基因设计4条特异引物,反应前加入钙黄绿素荧光试剂,63℃恒温反应60min,结束后通过目视检测荧光及浊度仪检测产物浊度值判断结果;评价所建立LAMP方法的特异性和敏感性,建立标准曲线,并用LAMP法及PCR法检测样本,比较样本检出情况。结果该方法特异性良好,PM出现特异性LAMP扩增反应,而烟曲霉菌、腐皮镰刀菌、棘状外瓶酶菌、大肠埃希菌、嗜水气单胞菌、哈氏孤菌、创伤孤菌、水等均未出现扩增;检测限约为1.7×10-7 ng/μl,为PCR检测方法的10倍;以LAMP反应时间X轴,浓度的负次方数为Y轴,构建的标准曲线方程为y=0.4145x-8.9968,相关系数R2=0.9963,呈良好的线性关系;样本检测结果显示,LAMP法较PCR法获得更高的敏感性。结论 LAMP检测方法具有特异性高、敏感性高、反应时间短的特点,简便易行,适合于基层对PM的快速检测。     

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的识别和序列分析及功能预测

目的 从马尔尼菲青霉菌(PM)酵母相全长cDNA文库中识别溶血磷脂酶基因,预测其结构和功能,为进一步实验研究提供理论依据.方法 利用NCBI在线分析工具对PM酵母相全长cDNA文库进行筛选,识别溶血磷脂酶基因;通过Vector NTI suite 8.0软件包,对其编码蛋白质的各种结构与功能特征进行预测,并构建种系分子进化树.结果 筛选得到的基因长1014 bp,Blastx分析该基因可能是编码PM溶血磷脂酶的全长基因,完整的开放读码框(ORF)共含729 bp,编码243个氨基酸;其编码蛋白的相对分子质量为26 800,预测等电点为5.49,疏水氨基酸占47.7%,亲水氨基酸占26.8%,酸性氨基酸占12.7%,碱性氨基酸占12.8%;该蛋白有潜在的2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和7个N-肉豆蔻酰位点.结论 该氨基酸序列属于溶血磷脂酶样功能域特征蛋白酶;与球孢子菌亲源关系最近.通过研究,一个PM溶血磷脂酶基因被成功发现,这为进一步探讨该基因的功能提供了条件.

Abstract：

Objective To identify the gene encoding lysophospholipase from the full length cDNA library of Penicllium marneffei (PM) in yeast phase and predict the structure and function of its deduced protein, to provide with theoretical evidences for further experiments. Methods The PM full-length cDNA library in yeast phase was screened to identify the gene encoding lysophospholipase with the help of NCBI on-line analytical tool. Then, by utilizing the software package of Vector NTI suite 8.0, the protein deduced by the gene was analyzed to predict its corresponding structure and functions, and its molecular cladogram was constructed. Results The gene was composed of 1014 base pairs in the length and was presumed to be the full-length gene encoding lysophospholipase by Blastx, with a complete open reading frame (ORF) comprised of 729 base pairs encoding 243 amino acids with relative molecular weight being 26 800 and the predicted isoelectric point being S.49. The deduced protein included 47.7% hydrophobic amino acids, 26.8% hydrophilic amino acids, 12.7% acid amino acids and 12.8% basic amino acids. The protein had 2 potential casein kinase Ⅱ phosphorylation site, 3 potential protein kinase C phosphorylation site and 7 N-myristoyl site. Conclusions The amino acid sequence belongs to this kind of protease with lysophospholipase-like domain. The protein is most close to Coccidioides posadasii in genetic relationship. A novel gene encoding lysophospholipase is successfully found and the work has made necessary preparations for further research on the gene's function.     

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的识别和序列分析及功能预测

Objective To identify the gene encoding lysophospholipase from the full length cDNA library of Penicllium marneffei (PM) in yeast phase and predict the structure and function of its deduced protein, to provide with theoretical evidences for further experiments. Methods The PM full-length cDNA library in yeast phase was screened to identify the gene encoding lysophospholipase with the help of NCBI on-line analytical tool. Then, by utilizing the software package of Vector NTI suite 8.0, the protein deduced by the gene was analyzed to predict its corresponding structure and functions, and its molecular cladogram was constructed. Results The gene was composed of 1014 base pairs in the length and was presumed to be the full-length gene encoding lysophospholipase by Blastx, with a complete open reading frame (ORF) comprised of 729 base pairs encoding 243 amino acids with relative molecular weight being 26 800 and the predicted isoelectric point being S.49. The deduced protein included 47.7% hydrophobic amino acids, 26.8% hydrophilic amino acids, 12.7% acid amino acids and 12.8% basic amino acids. The protein had 2 potential casein kinase Ⅱ phosphorylation site, 3 potential protein kinase C phosphorylation site and 7 N-myristoyl site. Conclusions The amino acid sequence belongs to this kind of protease with lysophospholipase-like domain. The protein is most close to Coccidioides posadasii in genetic relationship. A novel gene encoding lysophospholipase is successfully found and the work has made necessary preparations for further research on the gene's function.     

马尔尼菲青霉菌对支气管上皮细胞吞噬和细胞因子分泌的影响

目的探讨马尔尼菲青霉菌(PM)孢子对人支气管上皮细胞BEAS-2B吞噬和细胞因子分泌的影响。方法人HIV-分离株孢子与细胞培养6hPAS染色,观察孢子黏附细胞的情况;HIV-分离株孢子与细胞培养4h行荧光原位杂交(FISH),观察细胞吞噬孢子的情况;HIV-分离株孢子与细胞培养1~5h,透射电镜观察细胞吞噬孢子的过程;(人HIV-分离株孢子、人HIV+分离株孢子、FRR2161孢子、野生分离株孢子、及LPS分别加入以上4种分离株孢子、空白对照及LPS阳性对照组)10组实验组分别与细胞培养24、48、72h,用ELISA测定细胞上清液IL-6和IL-8浓度。结果 PAS染色示孢子紧紧黏附细胞;FISH示细胞能吞噬孢子;透射电镜示细胞吞噬孢子后,孢子细胞壁被破坏,细胞溶酶体增多和线粒体空泡化并轻度肿胀;3个时间段的LPS阳性对照组、孢子刺激组及孢子加LPS刺激组的细胞上清液IL-6及IL-8浓度均高于空白对照组(P<0.05)。结论 PM孢子与BEAS-2B细胞发生黏附后被吞噬,细胞内溶酶体将孢子消化破坏,并导致细胞分泌的IL-6和IL-8浓度增加。     

EPEC的分离鉴定及耐药性分析

肠致病性大肠埃希氏菌(ＥＰＥＣ)是引起婴幼儿腹泻的主要病原菌[1],但引起食物中毒的报道较少。1996年1月、1999年3月在深圳市龙岗区共发生了两起由ＥＰＥＣ所致的集体性成人细菌性腹泻。从流行病学调查分析表明均系食源性的细菌性食物中毒。其临床症状基本一致:呕吐、腹痛、腹胀、腹泻、水样便、微发烧、潜伏期为2～10小时。经对症治疗全部康复,无死亡病例。从两起病人粪便标本中分别分离到Ｏ125:Ｋ70、Ｏ44:Ｋ74二种型别3株ＥＰＥＣ。现将实验结果报告如下。1　材料与方法11　标本来源　分别采集两起典型急性腹泻病人大便标本各5份及10份…     

EPEC的分离鉴定及耐药性分析

肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)是引起婴幼儿腹泻的主要病原菌,成人少见.1996年1月、1999年3月在深圳市龙岗区共发生了两起由EPEC所致的集体性成人细菌性腹泻.流行病学调查分析表明均系食源性的细菌性食物中毒.从两起病人粪便标本中分别分离到O125:K70、O44:K74二种型别3株EPEC.现将实验结果报告如下.材料与方法标本分别采集于两起典型急性腹泻病人大便标本各5份及10份.     

从艾滋病患者痰与血培养中分离出马尔尼菲青霉菌1例

我们从1例艾滋患者痰和血液培养中同时分离出1株马尔尼菲青霉菌,现报道如下. 1病例 患者男,33岁,于2011年7月13 日因发热、咳嗽约16d入院,即抽血进行培养及相关检查,体温39.6℃,血压86/55mmHG,脉搏81次/min,呼吸24次/min,皮肤损害.胸片及CT呈弥漫性网结节状.血常规:白细胞1,09×109/L、中性0.58％、血红蛋白50 g/L、血小板90×109/L;血生化:C反应蛋白26mg/L、ALT67 U、r-GT74 U、TP56 g/L、ALB28 g/L;HIV初筛阳性,HIV确认试验阳性.2d后血培养瓶阳性报警,将血培养瓶转种培养出的微生物经签定为马尔尼菲青霉菌.     

马尔尼菲青霉菌病的研究进展

马尔尼菲青霉菌(penicillium marneffei,PM)是青霉菌属中唯一温度依赖型双相真菌,也是迄今所发现的惟一能使人体致病的青霉菌,它既能以菌丝相在24~28℃自然环境中生长,还能在35~37℃环境下以酵母相在人体内生长繁殖[1].人体内部由于受到马尔尼菲青霉菌侵入不能被巨噬细胞清除则形成马尔尼菲青霉病(penicilliosis marneffei,PSM),此病是引起免疫缺陷或免疫功能低下人群的一种机会感染致病性真菌病,目前全球多达十几个国家和地区均发现PM感染患者,在我国则以南部地区多见.