高糖通过ERK1/2途径调节足细胞产生明胶酶B

目的探讨高糖持续刺激对足细胞培养上清液明胶酶活性、Ⅳ型胶原的影响及可能的信号途径.方法小鼠足细胞系分为正常糖组、高糖组和甘露醇高渗对照组.应用明胶酶谱法观察三组细胞培养液上清明胶酶活性的动态变化,Western印迹分析法检测细胞培养液上清中Ⅳ型胶原α5链蛋白水平及足细胞ERK信号途径活化的变化.RT-PCR方法检测MMP-9 mRNA的表达.结果正常糖组和甘露醇高渗对照组培养液上清MMP-2和MMP-9活性在10天实验时间内无明显变化.高糖组细胞培养液上清MMP-2的活性没有明显变化;MMP-9活性于第2天开始升高,第3天达高峰为正常糖组的144.2±18.7%(P=0.006),第5天下降,第7天回到基础水平为正常糖组的76.6%±16.4%(P=0.218),直至第10天.足细胞培养上清中有较高基础水平的Ⅳ型胶原α5链蛋白;高糖组细胞培养上清Ⅳ型胶原α5链蛋白表达第2天开始下降,第3天达最低水平41.9%±25.5%(P=0.047),第5天回升到基础水平持续至第7天.上清MMP-9的活性与Ⅳ型胶原α5链蛋白的表达量呈负相关(r=-0.577,P=0.006).正常糖组和甘露醇高渗对照组细胞培养上清Ⅳ型胶原α5链蛋白无变化.高糖刺激足细胞2天MMP-9 mRNA水平增加为正常糖组的199.8%±40.2%(P=0.003),刺激5天时为正常糖组的90.9±8.8%(P=0.411).高糖刺激足细胞30 min可以活化ERK1/2,6 h达高峰,持续至24 h,48 h降至基础水平;在足细胞上未能检测到p38和JNK活化.ERK活化特异抑制剂PD98059预处理细胞后,能阻断高糖引起的MMP-9的活性和MMP-9 mRNA增加及Ⅳ型胶原α5链蛋白的下降.结论ERK信号传导途径介导了高糖刺激足细胞MMP-9生成及相应的Ⅳ型胶原α5链蛋白动态反向改变.     

高糖通过结缔组织生长因子诱导足细胞减少podocalyxin的表达

摘要：目的探讨高糖对小鼠足细胞podocalyxin表达的影响及结缔组织生长因子（CTGF）参与其损伤的可能机制。方法
构建针对CTGF基因的特异性siRNA质粒并转染至小鼠足细胞。将体外培养的足细胞分为6组( 1)正常对照组,正常足细
胞其培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,正常足细胞其培养基含D-葡萄糖1 g /L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,正常足
细胞其培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组：足细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照
组：足细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组：足细胞转染针对CTGF的siRNA表达质
粒后于高糖培养基中培养。Western blot 方法检测小鼠足细胞Podocalyxin、CTGF 蛋白表达及细胞外信号调节激酶
（ERK1/2）磷酸化水平。结果高糖培养足细胞24、48 h时均可下调其Podocalyxin蛋白表达量（P<0.05）,并可诱导CTGF
蛋白表达增加（P<0.05）。同时高糖可以活化足细胞ERK1/2信号途径,在高糖刺激30 min时开始活化,持续活化至24 h。
特异性siRNA干扰CTGF合成后,ERK1/2活化减少,并且足细胞Podocalyxin表达升高。结论CTGF是高糖诱导小鼠足
细胞损伤的重要介质,可通过ERK1/2途径诱导podocalyxin表达下降,针对CTGF的siRNA能明显改善podocalyxin表达
量,为DN的治疗提供新的思路。     

高糖对足细胞表达结缔组织生长因子及其受体蛋白的调节

目的:研究长期高糖对体外培养的足细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)及其受体--低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的影响以及可能涉及的信号途径.方法:以体外培养的小鼠肾小球足细胞为研究对象,应用Western印迹分析技术,检测高糖刺激不同时间对足细胞表达CTGF蛋白的影响.观察高糖对丝裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信号途径活化的影响以及MAPKS信号途径在高糖调节足细胞表达CTGF中的作用,同时检测高糖对足细胞CTGF的受体LRP蛋白的影响.结果:体外培养足细胞表达基础水平的CTGF蛋白,高糖刺激2天后足细胞表达CTGF水平开始升高,第4天达高峰,第6天下降,第8天降至对照组水平.正常糖和甘露醇组CTGF蛋白没有明显变化.高糖可以激活足细胞外信号调节激酶(ERK1/2),于刺激30 min时ERK1/2即开始活化,6 h达高峰,持续至24h,48 h接近基础水平.正常糖和甘露醇在各个时间点均不活化ERK1/2.应用ERK1/2活化特异抑制剂PD98059可以消减高糖刺激CTGF表达增加的效应.在各个时间点,长期高糖环境对足细胞CTGF的受体LRP蛋白没有明显作用.结论:短期(2～4 d)高糖通过活化ERK1/2信号通路刺激足细胞CTGF的表达,高糖继续培养(6～8 d)对足细胞内的CTGF蛋白表达水平没有影响.长期高糖环境对足细胞上CTGF的受体LRP蛋白的表达无影响.     

抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶5对小鼠足细胞凋亡的影响

目的探讨细胞周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)在高糖刺激体外培养小鼠足细胞中的表达及抑制Cdk5表达对高糖诱导足细胞凋亡的影响。方法 (1)体外培养条件性小鼠足细胞,分为正常糖组、甘露醇组、高糖组,高糖组按不同刺激时间分为0、6、12、24、48h5组,应用蛋白质印迹(Western blot)法检测足细胞中Cdk5蛋白表达水平。(2)应用Cdk5miRNA干扰质粒抑制足细胞中Cdk5基因的表达水平。分别设立:NG组(正常糖);HG组(高糖);HG+S组(高糖+Scrambled阴性质粒);HG+C组(高糖+Cdk5miRNA质粒)。以上各组细胞培养48h后,应用流式细胞术和末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)法检测足细胞凋亡水平,Western blot法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和分裂型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达水平。结果与正常糖组相比,高糖刺激后,足细胞中Cdk5的蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。Cdk5miRNA干扰质粒能显著抑制足细胞中Cdk5的表达水平。与HG组和HG+S组相比,HG+C组足细胞凋亡率显著降低(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved caspase-3蛋白表达水平和Bax/Bcl-2蛋白表达比率也有明显降低(P<0.05)。结论高糖刺激可以增加足细胞中Cdk5蛋白的表达水平;抑制Cdk5表达可以降低高糖刺激诱导的足细胞凋亡。     

TGF-β_1和TL1A在高糖所致血管内皮细胞凋亡中的作用

目的:观察高糖条件下,内皮细胞分泌的TGF-β1和TL1A对细胞凋亡的影响。方法:以22.4mmol/L葡萄糖培养细胞不同时间(0h,6h,12h,24h,48h),RT-PCR和Westernblot检测内皮细胞TGF-β1和TL1A表达,Annexin V-FITC/PI双染色、流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:高糖条件下HUVECTGF-β1和TL1A表达增加(均P<0.01),22.4mmol/L葡萄糖培养条件下,TGF-β1的表达高峰在12h,TL1A高表达峰值在48h。高糖条件下细胞凋亡率明显增加(21.06%±3.05%vs3.09%±0.32%,P<0.01)。在正常糖培养的HUVEC中加入外源性的TGF-β1和TL1A,均导致细胞凋亡率显著增高(15.26%±2.93%,55.70%±8.91%vs3.09%±0.32%,均P<0.01),在高糖培养液中加入抗TL1A抗体能明显抑制细胞凋亡发生(4.28%±0.48%vs21.06%±3.05,P<0.01),但加入抗TGF-β1抗体却不能逆转高糖诱导的细胞凋亡(20.93%±3.21vs21.06%±3.05%,P>0.05)。结论:高糖上调内皮细胞TGF-β1和TL1A的表达,TL1A介导高糖引起内皮细胞凋亡的作用,高糖引起内皮细胞凋亡与TGF-β1无关。     

高糖引起小鼠肾小球足细胞podocalyxin蛋白的表达下调

目的:探讨高糖对肾小球足细胞podocalyxin蛋白表达的影响及其信号途径.方法:免疫组织化学法检测db/db(自发糖尿病小鼠)肾小球足细胞podocalyxin蛋白表达,野生型小鼠(WT鼠)为对照,计算机图像半定量分析.以体外培养的足细胞为研究对象,应用Western印迹分析技术,检测高糖培养不同时间点对足细胞表达podocalyxin蛋白的影响; 检测细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号途径的活化,及其特异性阻断剂PD98059对podocalyxin蛋白变化的阻断效应.结果:免疫组织化学半定量分析显示db/db小鼠肾小球podocalyxin蛋白表达明显少于对照组[(0.18±0.07)比(0.25±0.05), P＜0.05].培养的足细胞表达基础水平的podocalyxin蛋白,高糖培养不同时间点其表达均下降,以第6天最明显(为对照组的5.5%, P＜ 0.01),正常糖和甘露醇组没有明显变化.高糖可以活化足细胞ERK1/2信号途径,于培养30 min时ERK1/2开始活化,6 h达高峰,持续活化至24 h,至48 h时接近基础水平;高糖培养不能活化P38和 JNK.正常糖和甘露醇在各个时间点均不影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路.ERK1/2特异阻断剂PD98059可以消减高糖引起的podocalyxin表达下降的效应.结论:自发糖尿病小鼠的肾小球足细胞podocalyxin蛋白表达下降.高糖经ERK1/2信号通路下调体外培养的足细胞podocalyxin蛋白表达.     

肿瘤热休克蛋白70-多肽复合物诱导特异性细胞毒T淋巴细胞产生的实验研究

目的　研究肿瘤细胞的热休克蛋白 70多肽复合物 (heatshockprotein 70peptide complexes ,HSP PC70 )诱导活化肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞 (cytotoxicTlymphocytes,CTL)的作用及该CTL的杀瘤效应。方法　利用细胞培养 ,流式细胞技术 ,蛋白质的分离纯化技术 ,电泳技术 ,Western blot检测方法 ,T淋巴细胞的诱导及体外扩增 ,酶标技术等 ,测定肿瘤HSP70 多肽复合物诱导活化小鼠体内CTL产生的作用。结果　HcaF细胞HSP PC70的自然表达率为 6 3.5 % ,热诱导后为 75 .5 % ;HcaF细胞的HSP PC70能够诱导活化肿瘤特异性的CTL ,该CTL在效靶比例为 5 0∶1、2 5∶1、12 .5∶1时于体外对HcaF细胞的杀伤效率分别为 84.2 %± 3.2 %、47.9%± 2 .6 %和 14.8%± 3.0 % ;该CTLCD3、CD8的阳性率分别为 93%± 7% ,92 %± 8% ;将活化的CTL注入荷瘤小鼠体内可见明显的治疗作用 ,注入 10 7CTL 4次后 ,10 0 %的小鼠获长期生存。结论　肿瘤来源的HSP PC70具有强大的免疫原性 ,可活化CD8 T淋巴细胞成为肿瘤特异性的CTL ,该CTL具有较高的体外杀瘤活性和良好的治疗作用。     

IgA肾病患者血清IgA1活化细胞外信号调节激酶并诱发肾小球系膜细胞增殖的作用

目的探讨IgA肾病(IgAN)患者血清IgA1对体外培养的正常人肾小球系膜细胞(HMC)细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化及细胞增殖的刺激作用,并比较其与正常人血清IgA1作用力的异同.方法亲和层析提取正常人及患者血清IgA1,加热聚合(aIgA1),原代培养正常人HMC,Western 杂交测定ERK 蛋白磷酸化,DNA荧光标记技术结合流式细胞仪观察HMC细胞周期变化,直接计数检测HMC增殖.结果 (1)患者及正常人aIgA1均呈时间依赖性诱发HMC ERK信号蛋白磷酸化、DNA 合成和细胞增殖,二者作用趋势相似,作用高峰时间分别为孵育15 min、24～36 h和48～72 h;(2)患者aIgA1刺激强度显著高于正常人aIgA1,在作用高峰时间,患者组和正常人组磷酸化ERK/总ERK 的比值分别为49.5%±10.1%和30.7%±4.4%,S-G2-M期细胞数所占的比例分别为(33.0%±0.3%和30.7%±0.7%,HMC计数分别为(57.78±2.45)×104/ml和(50±1.51)×104/ml,差异均有显著意义(P<0.05);(3)阻断ERK通路只能部分抑制患者aIgA1对HMC增殖的诱导作用. 结论 IgAN患者血清IgA1可以诱导正常人HMC ERK信号蛋白磷酸化并刺激细胞增殖,其作用强于正常人血清IgA1.     

热休克蛋白90和糖皮质激素受体比例失衡对哮喘患者T淋巴细胞凋亡的影响

目的探讨热休克蛋白90(HSP90)与糖皮质激素受体(GR)比例失调对T淋巴细胞凋亡的作用,同时观察地塞米松(Dex)对HSP90和GR mRNA表达的影响.方法选择10例哮喘患者和7例正常对照,利用格尔得霉素(GA)特异性阻断HSP90的作用, 造成功能性HSP90与 GR比例降低,用碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪计数凋亡细胞的方法,观察用Dex和GA处理的T细胞凋亡情况;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法观察Dex和GA处理对哮喘T淋巴细胞HSP 90和GR mRNA 表达的影响.结果 Dex可明显诱导哮喘T淋巴细胞的凋亡(3 3 .8%±3.2% 比 23.2%±1.5%,P<0.01),GA对T淋巴细胞的凋亡无明显影响,却可阻断Dex诱导T淋巴细胞凋亡的作用(24.5%±6.0% 比 33.8%±3.2%, P<0.01);De x对正常人T淋巴细胞的凋亡有诱导作用,但其程度较弱(25.9%±3.5% 比 23.1%±1.5%, P<0.05).Dex可抑制哮喘患者T淋巴细胞HSP90和GR 的表达(分别为1.23±0.16比1.68±0.38 和 0.42±0.06比0.54±0.07, P 均<0.05),GA对 Dex的这一作用有阻断作用,但GA本身对HSP90和GR mRNA的表达无明显影响.结论 HSP90/GR 比例降低可影响Dex诱导的T细胞凋亡;Dex对哮喘患者GR和HSP90mRNA的表达有下调作用,而 Dex的这一作用可被GA所阻断.     

长春新碱对类风湿关节炎滑膜细胞作用的研究

目的 :评价长春新碱 (VCR)诱导滑膜细胞凋亡作用在治疗类风湿关节炎 (RA)中的意义。方法 :采用光镜、电镜、流式细胞仪及 DNA凝胶电泳等方法对不同浓度的 VCR诱导 9例体外培养的 RA病人及对照组 5例骨关节炎 (OA)与 4例正常人(NC)关节滑膜细胞凋亡情况进行了研究。结果 :加药前 RA、OA及 NC组凋亡细胞百分率分别为 3.8%± 0 .6 %、0 .8%± 0 .3%及0。加药后均显著升高 ,RA组可高达 6 7.5 %± 15 .1% (P<0 .0 1) ,OA组为 38.4%± 6 .8% (P<0 .0 1) ,NC组为 15 .7%± 1.5 % (P<0 .0 1)。 RA组凋亡细胞百分率显著高于 OA组 (P<0 .0 1)和 NC组 (P<0 .0 1)。结论 :诱导滑膜细胞凋亡可能是 VCR治疗 RA的机制之一 ,同时可为临床选择合理药物及药量提供依据     

Effects of mitogen-activated protein kinase signal pathway on heat shock protein 27 expression in human lens epithelial cells exposed to sodium salicylate in vitro

The roles of mitogen-activated protein kinase （MAPK） signal pathway in sodium salieylate-induced expression of heat shock protein 27 （HSP27） in human lens epithelial cells （HLECs-B3） in vitro were investigated. HLECs-B3 were incubated in the fresh media containing sodium salicylate at different concentrations for different durations, and allowed to be recovered in fresh medium without sodium salicylate for different durations with or without pretreatment with p38MAPK inhibitor （SB203580）, ERK1/2 inhibitor （PD98059） and JNK/SAPK inhibitor （SP600125）. The expression of P38MAPK, ERK1/2, JNK/SAPK, phosphorylated P38MAPK, phosphorylated ERK1/2, phosphorylated JNK/SAPK and HSP27 was detected by Western blot. The expression of HSP27 mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. It was found there was only weak expression of HSP27 in normal HLECs. The expression of HSP27 was not detectable in HLECs-B3 that were exposed to sodium salicylate （55 retool/L） for 1-5 h. It was indicated that recovery from sodium salicylate （〉35 mmol/L） significantly increased the synthesis of HSP27. The expression of HSP27 was up-regulated in HLECs-B3 under sodium salicylate recovery for 3 h, reached the peak level for 6 h, and returned to the level of control cells by 24 h. Activation of P38MAPK from sodium salicylate stimulation occurred at 30th rain, and increased significantly at 1st h, then declined and renamed to baseline level at 3rd h under sodium salicylate recovery. Activation of ERK1/2 occurred at 1st h and reached the peak level at 6th h under sodium salicylate recovery. However, JNK/SAPK was inactivated by sodium salicylate. The expression of HSP27 could be down-regulated with the pretreatment of SB203580 and PD98059 jointly. It is concluded that sodium salicylate can induce the expression of HSP27 in HLECs-B3. The effects are mediated, at least in part, through the activation of P38MAPK and ERK1/2 signaling pathway.     

柴朴汤对哮喘大鼠肺组织MAL/MAPK/ERK 通路的影响

目的 探讨柴朴汤是否通过调控T 细胞成熟相关蛋白（MAL）/ 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ 细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路对哮喘大鼠发挥治疗作用。方法 健康SD 大鼠40 只,随机分为4 组,哮喘组、 柴朴汤组、使用柴朴汤+MAPK/ERK 通路抑制剂（PD98059）（柴抑组）、对照组,每组10 只。按照文献复制 哮喘大鼠模型,使用柴朴汤及PD98059 进行干预,采用RT-PCR 检测肺组织中MAL mRNA 的表达情况,免疫 组织化学检测肺组织中MAL、p-ERK1/2、IL-4 蛋白的表达。结果 哮喘组MAL mRNA 和蛋白表达水平最低, p-ERK1/2 及IL-4 的蛋白表达水平最高,与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）。与哮喘组比较,柴朴汤 组、柴抑组MAL mRNA 和蛋白表达水平增高,p-ERK1/2 及IL-4 蛋白表达水平降低（P <0.05）。但柴朴汤组 和柴抑组MAL mRNA 和蛋白比较无差异（P >0.05）,而柴抑组的p-ERK1/2 及IL-4 的蛋白表达低于柴朴汤组 （P <0.05）。结论 ① MAL/MAPK/ERK 通路参与了哮喘病理发展过程。②柴朴汤可通过上调MAL 的表达, 抑制MAPK/ERK 通路,减少炎症反应,进而延缓哮喘病变。     

吡格列酮抗高糖诱导H9c2心肌细胞炎性损伤的机制研究

目的 探讨PPAR-γ激动剂吡格列酮（pioglitazone, PGZ）通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路减轻高糖诱导的H9c2大鼠心肌细胞炎性损伤。方法 离体培养的H9c2细胞随机分6组,分别为低糖组（5.5 mmol/L葡萄糖,NG组）、高糖组（35 mmol/L葡萄糖,HG组）、高糖+不同浓度PGZ组（HG+5 μmol/L PGZ 、HG+10 μmol/L PGZ、HG+15 μmol/L PGZ、HG+20 μmol/L PGZ）,采用CCK8法检测各组细胞干预24、48 h后细胞活性变化;据CCK8结果选取NG组、HG组、HG+10 μmol/L PGZ （Low组）、HG+20 μmol/L PGZ （High组） 4组细胞干预48 h,ELISA检测各组细胞炎性因子TNF-α、IL-1β的含量,Western-blot检测各组细胞p-p38、p-p65蛋白的表达。结果 CCK8检测结果显示,与NG组比较,24、 48 h后HG组明显活力下降（P<0.01）,表明高糖可诱导心肌细胞损伤;与HG组比较,48 h后HG+10 μmol/L PGZ、HG+ 15 μmol/L PGZ两组细胞活力均升高（P<0.05）,HG+20 μmol/L PGZ组细胞活力明显升高（P<0.01）,提示PGZ可对高糖环境下心肌细胞起保护作用。干预48 h后ELISA结果显示,HG组TNF-α、IL-1β含量与NG组比明显升高（P<0.01）,提示高糖环境可致心肌细胞发生炎性损伤;与HG组比较,Low组IL-1β含量降低（P<0.05）,High组TNF-α含量降低（P<0.05）,IL-1β含量明显降低（P<0.01）。提示PGZ可减轻高糖诱导心肌细胞炎性损伤。干预48 h后Western-blot结果显示,与NG组比较,HG组p-p65和p-p38蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与HG组比较,Low组p-p65和p-p38蛋白表达均降低（P<0.05）,High组p-p65和p-p38蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。提示PGZ可下调高糖诱导心肌细胞NF-κB/p38MAPK通路的表达。结论 PPAR-γ激动剂吡格列酮可以减轻高糖诱导H9c2大鼠心肌细胞的炎性损伤,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号转导通路有关。     

来氟米特活性代谢产物A771726对高糖诱导足细胞凋亡的抑制作用

目的 观察来氟米特活性代谢产物A771726对高糖诱导足细胞凋亡的影响,探讨来氟米特对足细胞损伤的保护作用及可能的机制.方法 条件永生的人肾小球足细胞系分为正常糖组、高糖组、甘露醇高渗对照组、高糖+SB202190[p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路特异性抑制剂]组及高糖+A771726(来氟米特活性代谢产物)组.Western印迹法检测足细胞p38MAPK及磷酸化p38MAPK(p-p38)活性;流式细胞仪检测足细胞凋亡率.结果 (1)高糖刺激足细胞激活p38MAPK信号通路,p-p38蛋白表达明显增加,正常糖组和高渗对照组仅有少量p38活化;SB202190组及A771726组p-p38蛋白表达量较高糖组明显下降.(2)流式细胞仪检测到高糖刺激足细胞24 h后可见细胞凋亡增加,48 h凋亡最为明显,为(18.6±0.7)%,显著高于正常糖及高渗对照组;SB202190组及A771726组足细胞凋亡率较高糖组分别下降26%和17%,差异有统计学意义.结论 来氟米特活性代谢产物A771726能够减少高糖所致的足细胞凋亡,机制可能与其抑制p38MAPK活化相关.

Abstract：

Objective To explore the therapeutic effects of leflunomide metabolite A771726 on high glucose-induced podocyte injury and understand its mechanism.Methods The conditionally immortal human glomeroular podocytes were divided into nomal glucose group (NG) ,high glucose group (HG),mannitol group (MA),high glucose with SB202190 (a p38MAPK inhibitor) group and high glucose with active leflunomide metabolite A771726 group.The levels of p38MAPK and p-p38 protein were determined by Western blot.And the rate of podocyte apoptosis was evaluated by flow cytometry.Results (1) Podocytes with high glucose could activate the p38MAPK signaling pathway.The p-p38 protein expression was significantly elevated.Little activation of the pathways was observed in Groups NG and MA.As compared to HG,the p-p38 protein expression was significantly lowered in SB202190 and A771726 groups.(2) Apoptosis increased in podocytes with high glucose after 24 h.The apoptotic rate of group HG was the most dramatic at 48 h(18.6 ±0.7)%.It was significantly higher than those of Groups NG and MA.The group of high glucose with SB202190 and high glucose with active leflunomide metabolite A771726 could reduce the podocyte apoptosis by 26% and 17% respectively versus the HG group.And the difference was statistically significant.Conclusion Leflunomide can inhibit high glucose-induced podocyte apoptosis.And this effect may be involved in its inhibition of activation of p38MAPK.     

组织因子/活化凝血Ⅶ因子复合物对大肠癌LoVo细胞系表达基质金属蛋白酶-7的调控作用

目的:观察活化凝血Ⅶ因子(actived factor Ⅶ,FⅦa)对大肠癌LoVo细胞系表达基质金属蛋白酶-7(ProMMP-7)的影响,探讨其可能的组织因子信号转导通路.方法 :(1)用Western blot检测100 nmol/L FⅦa刺激LoVo细胞系不同时间点及不同浓度FⅦa刺激LoVo细胞系12 h后细胞ProMMP-7蛋白水平;用Western blot检测5 mg/L组织因子(tissue factor,TF)抗体预孵育LoVo细胞系0.5 h后再给予100 nmol/L FⅦa刺激12 h后细胞ProMMP-7蛋白水平.(2)观察用100 nmol/L FⅦa刺激时丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)各亚通路信号蛋白(包括细胞外信号调节激酶ERK1/2,丝裂原激活蛋白激酶P38及c-Jun-N末端蛋白激酶JNK)磷酸化水平变化.(3)在FⅦa刺激前0.5 h分别加入ERK1/2,P38和JNK信号通路特异阻断剂PD98059,SB203580和SP600125,培养12 h后检测细胞ProMMP-7蛋白的变化.结果 :(1)FⅦa可刺激LoVo系细胞表达ProMMP-7并呈时间依赖性和剂量依赖性,在刺激的12 h左右ProMMP-7达峰值,是正常对照组的5.5±0.6倍(P=0.006);用TF抗体预处理的LoVo细胞系,其FⅦa上调ProMMP-7表达的作用被完全阻断.(2)用100 nmol/L FⅦa刺激LoVo细胞5 min时,MAPKs磷酸化活性蛋白p-ERK1/2和p-P38表达水平开始增加,至10 min时达峰值(分别为对照组的2.2±0.3倍和3.9±0.5倍,P值分别为0.02和0.01),存在时间效应关系,而p-JNK活性无改变(为对照组的1.1±0.1倍).(3)ERK1/2通路阻断剂PD98059及P38通路阻断剂SB203580可部分减少FⅦa上调LoVo细胞系表达ProMMP-7的效应,分别降低了32%±5%(P=0.01)和61%±10%(P=0.009),JNK通路特异性阻断剂SP600125对ProMMP-7的表达无明显影响.结论: FⅦa通过与LoVo细胞表面的TF结合诱导ProMMP-7的表达,并呈时间依赖性和剂量依赖性;ERK1/2和P38 MAPKs亚通路参与LoVo细胞TF信号转导通路并与TF/FⅦa调控ProMMP-7表达有关.     

p38丝裂原活化蛋白激酶与c-Jun-N末端激酶信号通路反向调控血管紧张素Ⅱ诱导的人足细胞凋亡

目的:研究不同亚型的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),即p38MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)和cJun-N末端激酶(JNK)在血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)诱导的培养人体足细胞凋亡中的作用.方法:体外培养条件下,分别用ANGⅡ(10-8mol/L)或ANGⅡ与不同的MAPK抑制剂(SB02190、Pl98059、SP600125)处理人体足细胞;应用H-33342和碘化丙啶双染色形态学方法和DNA片段测定法检测细胞凋亡;应用Western印迹检测ANCⅡ刺激的MAPK活性改变.结果:ANGⅡ诱导足细胞凋亡呈时间和剂量依赖性;ANGⅡ刺激p38MAPK,而抑制JNK活性;p38MAPK抑制剂(SB202190)抑制ANGⅡ诱导的足细胞凋亡和p38MAPK活性;SP600125抑制JNK活性而促进了ANGⅡ诱导的足细胞凋亡.结论:ANGⅡ通过激活p38MAPK和抑制JNK活性诱导人体足细胞凋亡.     

丝裂原活化蛋白激酶在雷洛昔芬抑制前列腺癌细胞系PC3增殖中的作用

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在雷洛昔芬(RAL)引起雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞凋亡和细胞周期阻滞中的作用.方法 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度RAL作用48、72、96、120 h后对PC3细胞生长抑制率.不同处理因素作用后流式细胞仪分析细胞周期分布和亚二倍体峰,TUNEL染色检测细胞凋亡.Western印迹检测细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun N端应力激活的蛋白激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)活性以及Bel-2、磷酸化Bcl-2(p-Bel-2)、Bax和半胱氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)的表达.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测雌激素受体(ER)α、ERβ、细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白(P21WAF1)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)基因的表达.结果 RAL呈浓度依赖性抑制PC3细胞增殖.10-6mol/L RAL可以快速持续激活ERK1/2和p38,不激活JNK.处理因素作用48 h后,对照组、RAL、RAL+PD98059、RAL + SB203580组细胞凋亡率分别为0.9%±0.1%;22.9%±1.5%;15.2%±1.8%和9.7%±0.6%(P＜0.05).10-6 mol/L RAL使细胞阻滞在G1期,10 μm PD98059或SB203580预孵育1 h可减轻RAL此种作用.PC3细胞表达ERα和ERβ.RAL、RAL+PD98059、RAL+SB203580组中cyclinD1和P21WAF1基因表达分别为对照组的0.50±0.02、4.48±0.12倍;0.49±0.02、1.77±0.06倍;2.36±0.08、4.50±0.03倍(P＜0.05).Bcl-2、Bax和caspase-3(对照组、RAL、RAL+PD98059、RAL+SB203580)的表达分别是1、0.33±0.02、0.34±0.01、0.81±0.05;1、3.14±0.02、1.67±0.11、3.15±0.03;1、4.16±0.02、2.66±0.03、1.80±0.06.RAL作用1.5 h后p-Bcl-2增加,SB203580可以抑制RAL引起的p-Bcl-2增加.结论 RAL激活ERK1/2增加P21WAF1.基因表达,并激活p38抑制cyclinD1表达使细胞阻滞在G1期.RAL激活ERK1/2促进Bax表达,同时激活p38磷酸化Bcl-2使其表达减少,引起PC3细胞凋亡.     

人A431皮肤鳞状细胞癌中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路对P53的调节作用

目的  观察丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号通路的活化及抑制对皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞增殖、凋亡情况的影响,探讨MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53在皮肤SCC中的相互作用机制。方法  培养人A431皮肤SCC细胞株,分为低、中、高浓度的MAPK/ERK通路抑制剂（PD98059+DMSO）组及激活剂（IGF+PBS）组、空白对照（DMSO）组。噻唑蓝法检测细胞体外增殖活力,流式细胞术（FCM）检测细胞的凋亡,Western blot检测各组A431细胞中P-ERK、P53蛋白表达。结果  经不同浓度的抑制术PD98059处理A431细胞,细胞增殖受到抑制,呈浓度-效应和时间-效应关系（P <0.05）;经不同浓度的激动剂胰岛素样生长因子（IGF）处理A431细胞,细胞增殖受到促进,呈浓度-效应和时间-效应关系（P < 0.05）。FCM检测结果显示,PD98059作用于A431细胞,细胞凋亡率明显增高,呈浓度-效应关系（P <0.05）;而IGF作用于A431细胞,细胞凋亡率明显降低,呈浓度-效应关系（P <0.05）。Western blot检测结果显示,PD98059处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达降低,P53蛋白的表达增强,随着PD98059浓度的增加,P-ERK蛋白明显降低,P53蛋白明显增强（P <0.05）;而IGF处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达增强,P53蛋白的表达降低,随着IGF浓度的增加,P-ERK蛋白明显增强,P53蛋白明显降低（P <0.05）;经过Pearson相关性分析,P53与P-ERK的表达呈负相关（P <0.05）。结论  人A431细胞中MAPK/ERK信号通路被IGF激活后,促凋亡因子P53表达降低,细胞增殖能力增强,凋亡能力降低;而该通路受抑制后,促凋亡因子P53表达增高,细胞增殖能力降低、凋亡能力增强。