多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能,构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列,亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1,脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞,采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2,并成功转染入SHG-44细胞,为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

Northern杂交检测多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2在不同肿瘤细胞中的表达水平

目的：从mRNA水平检测五种不同肿瘤细胞株中多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)的表达情况。方法：采用Northern杂交方法。结果：Northern杂交结果显示了两条区带,并且pp-GalNAc-T2在不同肿瘤细胞中存在表达差异。结论：PP-GalNAc-T2基因在不同细胞存在差异表达并可能存在着剪切现象。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2酵母双杂交载体构建及激活检测

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用,构建pGADT7／ppGalNAc—T2载体,并转化酵母AH109进行激活检测。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,亚克隆至酵母双杂交载体pGADT7,醋酸锂法转染酵母AH109,并进行激活检测。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pGADT7／ppGal—NAc-T2载体构建成功。并转化酵母AH109,激活检测呈阴性。结论：成功构建了pGADT7／ppGalNAc—T2载体,并进行了激活检测,为进一步研究ppGalNAc-T2的功能奠定了基础。     

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的：研究反义封闭ppGalNAc-T2基因表达对胃癌细胞GC7901细胞增殖以及肿瘤细胞生物学行为的影响,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901。方法：在对几种肿瘤细胞的ppGalNAc-T2基因的表达水平分析后,以高表达ppGalNAc-T2的人胃癌细胞GC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度ppGalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞GC7901细胞pp-GaINAc-T2基因表达的亚细胞克隆。通过荧光显微镜、RT-PCR技术手段检测封闭反义ppGalNAc-T2基因RNA表达。结果：ppGalNAc-T2反义表达质粒载体pEGFP-FDT2和pEGFP-FXT2经限制性酶切及部分序列分析证明基因已正确插入载体中,荧光显微镜及RT-PCR显示转染成功。结论：成功构建了ppGalNAc-T2反义表达质粒载体,反义封闭pp-GaINAc-T2基因表达后,胃癌细胞GC7901ppGalNAc-T2的含量明显降低,为进一步研究ppGalNAc-T2奠定了基础。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族分子进化的初步研究

目的：探讨人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员间的同源性，揭示其进化规律。方法：采用生物信息学软件和网上数据库对核酸蛋白质序列进行同源比较，结构域分析和进化树绘制。结果：人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族一级结构、二级结构均有较高的同源性，系统进化树显示各成员来源于同一祖先并在不同时期分野。结论：各成员来自于同一祖先的同一家族，其进化方式属于趋异性进化。     

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建稳定的转染人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)基因的RNAi载体.方法:遵循RNA干扰目标序列的选取原则,对ppGalNAc-T2基因mRNA序列设计五条可能的小干扰RNA(siRNA),PCR方法扩增得到siRNA内源表达系统,转染至人胃癌细胞株SGC7901,运用RT-PCR方法检测筛选得到其中能高效引起ppGalNAc-T2基因表达沉默的siRNA;化学合成带荧光标记的该段RNA Oligo,转染细胞并用荧光显微镜观察转染情况,进一步鉴定该siRNA对ppGalNAc-T2的抑制作用;构建ppGalNAc-T2的RNA干扰真核表达载体,酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞并经G418筛选得到稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,RT-PCR方法检测该转染细胞株ppGalNAc-T2表达水平.结果:采用RNAi技术,将高表达ppGalNAc-T2的SGC7901细胞的T2表达水平明显降低.结论:成功构建稳定的ppGalNAc-T2基因敲减细胞株,为今后进一步深入研究ppGalNAc-T2的生物学功能奠定了基础.     

采用TOPO-TA克隆法建立多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA文库

目的：通过实验方法建立多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA文库，欲以此为基础对人体不同肿瘤细胞中的该基因家族进行表达谱分析。方法：主要为PCR和TOPO-TA克隆技术。结果：通过电泳图谱初步证实了这一家族的不同成员均已得到有效的扩增，并获得了相应的片段库。结论：多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA被成功扩增，并建立了该基因家族的eDNA文库。     

siRNA下调Smad3基因后对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶表达的影响

目的以Smad3基因为研究对象,筛选出该基因的有效siRNA干扰载体,并探讨下调表达Smad3基因对多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶（ppGalNAcTs）家族mRNA水平表达的影响。方法将事先构建的3个带有荧光标记的干扰载体分别转染人肝星状细胞株（HSC）中,通过RT-PCR、Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平检测干扰效率。并通过转染有效的Smad3基因的siRNA表达载体,检测下调Smad3以后对糖基转移酶ppGalNAcTs家族mRNA表达的影响情况。结果成功筛选到Smad3基因的有效siRNA干扰载体,检测出转染了Smad3的siRNA表达载体的肝星状细胞中Smad3的mRNA和蛋白表达都受到了抑制,而糖基转移酶ppGalNAcTs的mRNA表达也随之发生了一些变化。结论成功筛选到一个Smad3基因的siRNA干扰载体,继而可转染人肝星状细胞,并抑制其中Smad3蛋白的表达,为研究siRNA方法在肝纤维化中的治疗作用提供了实验基础和理论支持。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族在不同生长阶段的小鼠脑中的mRNA表达差异

目的:观察小鼠脑中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(polypeptide:N-acetylgalactosaminytransferase,ppGalNAc-T)在五个不同生长阶段的表达差异.方法: 采用RT-PCR方法从mRNA水平上研究ppGalNAc-T家族的表达,以管家基因β-actin为内对照进行半定量分析.结果:小鼠脑中T1,T2,T4,T6,T9,T10,T13,T14稳定表达,T3,T5,T7,T11,T12未检测到有表达;T1,T2,T4,T9,T14在各生长阶段表达都较高,T6,T10相对表达较低,而T13的表达变化较显著.结论:在小鼠脑的生长发育过程中ppGalNAc-T家族尤其是T13的表达有显著变化,提示ppGalNAc-T13在小鼠脑发育中有着重要作用.ppGalNAc-T家族在神经系统发育中所起的作用有待进一步深入研究.     

ppGalNAc-T2对胃癌细胞株SGC-7901生物学性能的影响

目的探讨多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-T2）对胃癌细胞株SGC-7901细胞性能的影响。方法构建ppGalNAc-T2RNA干扰真核载体（pSilenCircle-SiT2）、正义真核表达载体（pEGFP-C1-T2）及空载体（pEGFP-C1）,分别转染胃癌细胞株SGC-7901细胞。MTT法检测上述各组转染后细胞对SGC-7901细胞增殖的影响;细胞黏附和穿膜实验分别检测其黏附力和迁移力的变化;同时采用RT-PCR和Westernblot检测MMP2、MMP14、TGF-β1等与肿瘤细胞浸润、转移、增殖相关基因mRNA及蛋白的表达水平。结果转染正义真核表达载体的SGC-7901细胞,随着ppGalNAc-T2表达量的增加,细胞的生长增殖受到抑制,并对纤连蛋白、基质胶和透明质酸的黏附能力降低,但其侵袭迁移能力变化不明显;而转染ppGalNAc-T2RNA干扰载体的SGC-7901细胞,细胞生长最快。ppGalNAc-T2与肿瘤细胞相关因子TGF-β1、MMP2的mRNA表达水平成负相关,但对MMP14无明显影响,Western blot检测相关蛋白结果与mRNA表达水平基本一致。结论ppGalNAc-T2可影响胃癌细胞株SGC-7901细胞的增殖、黏附能力,并影响与肿瘤细胞浸润、转移、增殖相关基因mRNA及蛋白的表达水平。     

人多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2对胶质瘤细胞U251中MMP-2、TIMP-2 mRNA表达及细胞迁移能力的影响

目的探讨多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2（ppGalNAc-T2）对胶质瘤细胞侵袭转移的作用。方法将ppGalNAc-T2的真核表达正义载体、RNA干扰载体通过脂质体稳定转入胶质瘤细胞U251;通过荧光显微镜观察及RT-PCR检测ppGalNAc-T2的表达来确定载体正确转入细胞;细胞分为以下5组：U251转染正义载体组与空载体组、U251转染干扰载体组与对照载体组、U251未转染组,通过RT-PCR方法检测各组细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-2mRNA表达的变化;通过划痕法检测各组细胞的迁移差异。结果荧光显微镜观察及RT-PCR检测结果表明,载体成功转入细胞;RT-PCR检测结果发现,随着ppGalNAc-T2的增高,MMP-2的表达降低,而TIMP-2的表达升高（P〈0.05）;划痕结果显示,正义组细胞迁移能力随ppGalNAc-T2的上调而减弱（P〈0.05）,干扰组划痕修复较快（P〈0.05）,其他对照组相近（P〈0.05）。结论 ppGalNAc-T2的上调可抑制细胞的划痕修复,由此推测ppGalNAc-T2可能与胶质细胞的侵袭转移密切相关。     

儿童早期表达性语言障碍的临床干预研究

目的：探究综合性干预对儿童早期表达性语言障碍的治疗效果。方法该研究方便选取该院在2012年1月—2016年1月收治的80例早期表达性语言障碍儿童,随机分为观察组和对照组各40例,对观察组儿童行综合性治疗,对照组行一般性干预治疗,观察两组儿童在采用不同干预措施后总有效率和DQ比较,并将所得结果进行对比分析研究。结果在总有效率方面,观察组(100%)和对照组(90%)具有显著差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论对早期表达性语言障碍儿童进行综合性干预,能有效改善儿童语言表达能力,提高临床疗效、稳定儿童情绪,因此该方法值得在临床上推广和使用。     

壳聚糖对白血病细胞糖基转移酶表达的影响及对细胞的抑制作用

目的:观察壳聚糖对白血病细胞(K562,SHI-1)的作用。方法:以不同浓度的壳聚糖处理白血病细胞K562后,运用RT-PCR方法检测实验组K562细胞中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2(ppGalNAc-T2)mRNA表达差异。另用不同浓度的壳聚糖分别作用于白血病K562细胞和SHI-1细胞,MTT法检测壳聚糖对两种细胞的相对抑制率。结果:与阴性对照组比较,实验组K562细胞的ppGalNAc-T2表达降低,且随壳聚糖浓度升高,表达量进一步减少;MTT实验显示不同浓度的壳聚糖对K562细胞和SHI-1细胞均有抑制作用,并呈浓度依赖性。结论:壳聚糖对肿瘤细胞有一定的抑制作用,同时还可以减少ppGalNAc-T2在mRNA水平的表达。     

自发性糖尿病长爪沙鼠环氧化酶(COX)-2在三种组织中的表达

目的 研究环氧化酶(COX)-2基因在糖尿病长爪沙鼠3种组织中的表达水平,进一步探索其与长爪沙鼠糖尿病发生和发展的关系.方法 选取糖尿病长爪沙鼠和正常沙鼠各6只,分别采集动物的骨骼肌、肝脏和肾脏组织,用实时PCR和Western blotting检测COX-2基因在各组织中mRNA和蛋白表达水平.结果 实时PCR的结果表明,COX-2基因的mRNA水平在糖尿病组动物的骨骼肌组织中表达与对照组无明显差异,而肝脏和肾脏组织中有表达升高趋势.Western blotting结果显示,糖尿病组COX-2的蛋白水平在肝脏和肾脏组织中存在表达升高趋势,且肾脏具有统计学意义.结论 COX-2在糖尿病长爪沙鼠肝脏和肾脏组织中表达升高,在肾脏组织尤其明显,说明COX-2对长爪沙鼠糖尿病的影响可能发生在肝脏和肾脏组织中.     

三种不同方法建立兔肝VX2肿瘤模型的实验研究

目的探讨建立兔VX2肝癌模型的最佳方法.方法30只新西兰白兔,随机分为3组.A组超声引导经皮穿刺肿瘤组织条,B组超声引导VX2瘤组织块悬液,C组切开腹瘤块包埋.比较不同植瘤方式肿瘤的生长特点,超声监测肿瘤生长.结果A、B、C三组接种成瘤率分别为：90%、90%、100%;单发率90%、20%、80%;异位种植率10%、80%、20%.平均存活时间：A组（43.2±5.6）d,长于B组（34.5±3.6）d及C组（41.2±3.5）d,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论超声引导经皮穿刺肿瘤组织条种植法对肝组织的损伤小,成功率高、模型性质稳定,是可推荐的建立兔肝癌模型方法.