APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的 克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备.方法 按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段.该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达.结果 扩增片段长度为285 bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确.Western印迹证实pEGFP-C1-APC11在真核细胞内表达.结论 成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP-C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段,连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

hLMO3基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO3基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pE...     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的 构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率.方法 合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSilencer载体,构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体.将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平.结果 酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT-PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43.6 %、47.7 %和81.6 %,它们的干扰效果被Western印迹所证实.结论 干扰率为81.6 %的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,它可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究.     

hNaDC1基因5''''侧翼区转录调控序列系列载体构建与鉴定

目的构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法PCR扩增获得hNaDC1基因5’侧翼转录调控区不同长度片段:hNaDC1A(-2232/ 136,2368bp)、hNaDC1B(-1640/ 136,1776bp)、hNaDC1C(-1084/ 136,1221bp)、hNaDC1D(-253/ 136,389bp)、hNaDC1E(-2232/-12,2244bp),以pGL3-Basic为载体构建hNaDC1基因5’侧翼序列系列缺失质粒。重组体通过特异限制性内切酶酶切鉴定,并送样测序鉴定。结果成功构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体5个:pGL3-hNaDC1A～E。结论为进一步研究NaDC1基因5’侧翼区转录调控元件的分布特点及转录调控元件与转录因子间的相互作用提供了基本实验条件。     

含TK自杀基因真核表达载体的构建和鉴定

基因治疗恶性肿瘤是当前国内外研究的热点之一，其中以药物敏感基因治疗系统最引人注目。药物敏感基因(drug sensitive gene)又称为“自杀基因”(suicide gene)，可以编码某些病毒或细菌的酶类，从而催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体转变为具有毒性的代谢产物，干扰细胞DNA的合成，选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞，而对正常组织无毒、副作用。     

SOD1真核表达载体的构建及表达

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染HeLa细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用RT-PCR、Western blot检测SOD1的表达。结果:成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒,转染HeLa细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;RT-PCR及Western blot检测结果表明,所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。结论:成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1,为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。     

β-catenin基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的构建β-catenin真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取工具细胞NIH3T3的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增β-catenin基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞NIH3T3细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-β-catenin在NIH3T3细胞内的定位。结果β-catenin基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为2346 bp,并测序成功。Western blot检测到了GFP-β-catenin融合蛋白表达,分子量约为115kDa。pEGFP-β-catenin在工具细胞NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。结论成功构建了β-catenin基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-β-catenin蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。     

HERG基因的体外转录、表达及测定

目的 :长QT综合征 (LongQTSyndrome ,LQTs)是由于编码心脏离子通道的基因突变导致相应离子功能异常而引起的以QT间期延长 ,突发晕厥 ,惊厥甚至猝死为特征的心脏病。目前已证实 6种遗传学异常与常染色体显性遗传LQTs有关 (LQT1- 6 )。LQT2的基因定位于第 7号染色体 (7q35 - 36 )的HERG基因 (ether -a -go -go -relatedgene) ,调控延迟整流钾电流中快速型(Ikr)。本文将以HERG基因为例 ,将电生理和分子生物学技术结合起来 ,从基因的角度研究离子通道。方法 :在体外将离子通道HERG基因的质粒cDNA转化到大肠杆菌DH5α中扩增、提…     

珠蛋白基因特异性表达的调控

一、珠蛋白基因结构与特异性表达 人类珠蛋白基因包括已确定的八个珠蛋白功能基因和三个珠蛋白假基因,还有一个近年发现的基因,它们在两条染色体上排列成簇。α-珠蛋白基因簇位于16号染色体短臂上,以5′ζ_2-ψζ_1-ψα_2-ψα_1-α_2-α_1-θ_1-3′的顺序排列,约占30kb。其中ζ为胚胎型功能基因、ψζ与ψα为假基因,θ基因的功能有待研究,另外在22号染色体上还有一个ψθ_2假基因。β     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

肾素的基因结构及表达

高血压是严重危害人类健康的常见病、多发病,目前我国高血压患者约6千万人。高血压是多原因疾病,发病机制复杂,其机制和防治研究是基础和临床医学的重要项目。本专题汇集了有关高血压病因的遗传、神经、饮食营养因素等基础理论和临床研究的综述六篇,其中二篇介绍了肾素—血管紧张素系统的分子生物学研究,是当前学科的前沿工作;另一篇介绍了红细胞内的高血压因子和抗高血压因子,均饶有新意。饮食营养因素的研究重点介绍了我国在高血压人群防治工作中的成就,值得一读。     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的 研究早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)中含环指/B-BOX结构与含coiled-coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达.结果 成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD-PML-B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD-PML-C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 含环指/B-BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled-coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础.     

KIR3DL1基因启动子亚克隆及表达调控载体的构建

为研究KIR3DL1基因的表达调控机制,亚克隆KIR3DL1基因的核心启动子序列,并构建KIR3DL1基因启动子-荧光素酶报告载体,采用PCR法从含有KIR3DL1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增KIR3DL1基因核心启动子序列,产物纯化回收后与pGEM-T easy载体连接,测序鉴定正确的重组子经限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ双酶切后,插入同样经BglⅡ和NcoⅠ双酶切的用于基因表达调控研究的pGL3-Basic报告载体,最终获得了长度为254bp的KIR3DL1基因启动子克隆,构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体.通过酶切及基因测序的方法证实所构建的重组子是正确的,说明KIR3DL1基因启动子表达调控载体的构建是成功的.     

重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达

目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。     

弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达

目的：构建elafin基因高效表达重组腺病毒载体Ad-elafin。方法：抽提人肺总RNA进行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）扩增elafin基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上；在BJ5183细菌内与pAdEasy-1同源重组，筛选阳性克隆，酶切、PCR及测序鉴定；PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得腺病毒载体Ad-elafin；继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测elafin蛋白的表达，ELISA鉴定elafin蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用。结果：酶切、PCR、蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功。结论：成功构建了重组腺病毒载体Ad-elafin，为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。     

Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应

背景：研究提示抑制Smad3可望抑制纤维增生和胶原的大量产生。 目的：构建针对Smad3基因的siRNA表达载体,观察RNA干扰对增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。 方法：根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染增生性瘢痕成纤维细胞,荧光定量PCR和Western blot方法检测Smad3基因的表达情况。 结果与结论：测序分析结果显示：克隆入pRNAT-U6载体的针对Smad3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段插入正确;荧光定量PCR和Western blot检测显示：转染的增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因的表达水平明显降低,尤以AGA CAG ACT GTG ACC AGT A(1156)为靶序列的siRNA沉默作用最强,抑制效率于转染后48 h可达45%。证实实验构建的沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功。     

小鼠GM-CSF基因真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的：构建小鼠GM－GSF基因的高效真核表达载体，筛选导入该载体后高水平表达GM－CSF的小鼠淋巴瘤细胞系RMA，并探讨转GM－CSF基因瘤苗治疗小鼠T淋巴细胞瘤的方法。方法：PCR扩增小鼠GM－CSF cDNA3‘端770bp的片段，将其插入真核表达载体pcDNA3；用电穿孔法将构建的载体导入小鼠淋巴瘤细胞系RNA，有限稀释法制备单个细胞克隆，经RT－PCR、骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM－CSF的RNA克隆，该克隆细胞经丝裂霉素灭活后免疫小鼠以诱导其产生抵抗RMA肿瘤细胞再攻击的能力。结果：构建的重组质粒含有预期片段，插入方向正确，核酸序列无误，且获得了高表达GM－CSF的RMA克隆，将其用丝裂霉素灭活免疫小鼠后使它们产生了抗肿瘤免疫保护力。结论：转GM－CSF基因瘤苗可能作为有效的抗T淋巴细胞瘤瘤苗。