慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立

目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型。     

Preparation of lentivirus-mediated HLA-G transgenic mice

[目的]以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物.[方法]利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G.用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒.通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度.用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达.[结果]载体BamH I、EcoR I双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致.浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求.PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达.[结论]通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型.     

慢病毒载体及应用研究进展

慢病毒（Lentiviral）又叫逆转录病毒,属于逆转录病毒科（Retrovidae）,是一种RNA病毒。由于这种病毒中含有逆转录酶,故名逆转录病毒。慢病毒在宿主细胞内,能以RNA为模板,在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达。慢病毒载体（Lentiviral Vector,LV）是由慢病毒以其基因组为基础去除部分基因,代之以所需的目的基因和标记物构建而成,与其它载体比较,慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率较高、     

病毒滴度和插入子长度对慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响

目的 研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响.方法 制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体,通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠,然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率,并对所生成的数据进行统计学分析.结果 插入子长度在较短(＜2 kb)的情况下,病毒滴度达到2×108就可获得较高的整合率,在插入子长度稍长(4～5 kb)的情况下,需要1×109滴度才能获得较高的整合率,而在插入子长度大于6 kb的情况下,未能用该方法获得转基因小鼠.结论 滴度的增加能有效提高慢病毒载体制备转基因小鼠的整合率,而当滴度适中(～2×108)时,整合率随插入子长度的增加而下降.     

转基因动物技术与转基因动物制药

转基因动物技术始于上个世纪 80年代 ,2 0多年来 ,转基因动物在制作方法上由最初的显微注射法、逆转录病毒法和胚胎干细胞法 ,发展到体细胞核移植技术、腺病毒载体法、精子头与转移基因共注射法等。随着转基因技术的不断发展 ,利用转基因动物生产药用蛋白质即转基因动物制药的研究也取得了突破性进展 ,目前 ,转基因动物制药正走向产业化的道路 ,具有十分广阔的前景     

慢病毒载体法制备遗传工程猴和小型猪的现状及应用前景展望

较小鼠等啮齿类动物而言,猴和小型猪等大型实验动物在亲缘关系上与人类更为接近,在解剖、生理生化代谢及疾病发病机制等多方面与人类更接近,使它们在复制人类疾病模型,研究疾病发病机制和新药研发等中有无可替代的应用。而制备遗传工程大动物可以更深入地解析人类疾病,并可为器官移植和新药研发提供更充分的实验材料。基于慢病毒介导的转基因方法近几年已越来越多地被用来制备遗传工程猴和小型猪。与传统的原核显微注射方法和体细胞核移植法相比,慢病毒介导的转基因方法转基因效率高,操作更简单。因此,构筑基于慢病毒介导的转基因方法制备遗传工程猴和小型猪的技术平台将对生物医学研究产生巨大推动作用。     

慢病毒——一种新基因载体的研究和应用

慢病毒载体是一种逆转录病毒载体，具有可感染非分裂细胞、感染效率高、免疫反应小等众多优点，有望成为理想的基因载体应用于基因治疗，基因结构功能研究等领域。     

转基因动物技术与转基因约

转基因动物技术始于上个世纪80代，20多年来，转基因动物在制作方法上由最初的显同注射法，逆转录病毒法和胚胎干细胞法，发展到体细胞核移植技术，腺病毒载体法，精子头与转移基因共注射法等。随着转基因技术的不断发展，利用转基因动物生产药用蛋白质即转基因动物制药的研究也取得了突破性进展，目前，转基因动物制药正走向产业化的道路，具有十分广阔的前景。     

受精前卵细胞卵周腔显微注射法制备转基因动物

在医学实验动物模型、生物反应器、器官移植、禽畜活体内的基因表达调控、禽畜育种及品种改良等科学研究领域中,转基因动物技术有着广泛的应用前景[1]。目前转基因动物的制备,主要是在动物胚胎发育的不同阶段采用原核显微注射法、逆转录病毒载体法和胚胎干细胞法等技术,但...     

iRhom2及其突变基因重组慢病毒的包装和稳定表达细胞系的建立

目的：通过重组慢病毒感染,建立iRhom2及其突变基因的Vero细胞稳定细胞表达系,用于iRhom2的功能研究。方法：将iRhom2 及其突变基因克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染Vero细胞,利用puromycin进行加压筛选,获得二者的重组表达细胞系。 结果：构建了iRhom2及其突变基因的逆转录病毒载体,并获得了重组逆转录病毒病毒,并利用该病毒获得了二者的稳定表达细胞系Western-blot实验证实,二者能够在Vero细胞内稳定表达。结论：利用重组逆转录病毒感染,成功获得了iRhom2及其突变系的Vero细胞稳定表达株,为进一步研究iRhom2的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.     

CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

摘要：目的  构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法  通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果  经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论  成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。

     

N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基/RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC)神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl-D-aspar-tate,NR2B)对晚期癌痛患者的恶性情绪体验形成具有重要作用。构建靶向NR2B基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,可为下调ACC神经元NR2B靶基因的表达提供有力工具。方法构建靶向目的基因NR2B的RNAi重组慢病毒表达载体并酶切鉴定,再以NR2B/RNAi慢病毒表达载体和NR2B的基因表达质粒共转染293T工具细胞,以Westernblot方法检测其对目的基因NR2B的敲减效率。结果酶切鉴定NR2B/RNAi慢病毒表达载体Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ构建成功。West-ern blot结果显示,NR2B/RNAi慢病毒表达载体Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ均对NR2B靶基因有敲减效果,但以NR2B/RNAi慢病毒表达载体Ⅲ效率最高。结论成功构建可高效沉默NR2B靶基因的NR2B/RNAi慢病毒表达载体,为下调ACC神经元NR2B的基因表达治疗晚期癌痛患者的恶性情绪体验提供了有力工具。     

转基因动物技术研究进展

转基因动物技术起始于上个世纪七十年代末,随着生物科学的飞速发展,此技术也得到很大的进步。转基因动物技术在生物医药、农业等领域具有重要的作用。本文就转基因动物技术的发展、方法、应用及面临的问题做一综述。     

绿色荧光蛋白基因在白血病细胞K562中的转导效率

目的：探讨慢病毒载体在白血病细胞中的基因转导效率,为白血病基因治疗提供关键依据。方法：应用1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而成的第3代自身失活(SIN）慢病毒载体（lentiviral vector）系统,与鼠白血病病毒（MLV）SIN载体进行比较,通过荧光显微镜观察细胞内标记基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况,应用流式细胞术检测基因导入细胞百分比,评价两种载体系统在人白血病细胞系K562中的基因转导效率。结果：通过荧光显微镜可定性观察GFP在K562细胞中的表达情况,在同样的基因转导条件下,HIV载体转导的白血病细胞中被转导的标记基因GFP的表达强度及GFP阳性细胞数明显高于MLV载体转导的细胞。流式细胞仪定量检测HIV载体的转导效率接近100%,而MLV低于40%,两组间转导效率比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：基于慢病毒载体基因转导的高效性,该载体系统可作为白血病细胞基因转导的极好工具。     

转基因动物研究进展

转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导入动物染色体基因组,使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。目前制备转基因动物的方法主要有显微注射法,反转录病毒感染法,胚胎干细胞法等。转基因动物技术已广泛渗透于分子生物学、免疫学、生物制药、畜牧育种以及器官移植等研究领域中。本文通过对当前转基因动物的研究进展做出分析,以探讨当前转基因动物的发展方向和展望未来转基因动物的前景。     

靶向rPTTG的shRNA慢病毒载体构建及沉默效率评价

目的构建并筛选能高效沉默大鼠垂体瘤转化基因（rPTTG）的shRNA慢病毒重组载体。方法设计并合成4组特异性针对大鼠PTTG基因的shRNA序列将其构建到慢病毒载体pGCL GFP中;评估慢病毒重组载体在大鼠肾细胞中的转染效率并运用real time PCR技术检测各组重组载体对目的基因的沉默效果。结果PCR及测序结果显示,目的片段插入正确,重组载体构建成功,慢病毒重组载体转染效率达70%以上;4组shRNA序列均有基因敲减效果,并且第4组shRNA(4# shRNA)序列效果最为明显（＞80%）。结论成功构建了高效沉默rPTTG基因的慢病毒载体;验证了慢病毒载体作为RNAi载体工具转染效率的可靠性;实验显示4# shRNA能高效抑制内源性rPTTG基因表达。     

过敏性哮喘动物模型在致敏、哮喘发作和气道高反应性等方面的应用研究

过敏性哮喘的发病率呈上升趋势。使用了几十年的主要治疗药物肾上腺糖皮质激素副作用较大,因此发现好的预防和治疗方法成为迫切要解决的问题。动物模型是研究人类疾病的重要手段,但不少疑难病的发病机理不明确,因而制备的动物模型和人类疾病的相似度有差异。但Ⅰ型变态反应作为过敏性哮喘的发病机理是比较明确的,据此制备的动物模型和人类的哮喘就有很高的相近度,结果的可信度就较高。本文回顾了哮喘动物模型制备的基本方法和某些重要的细节。着重讨论了当今最常用的气道高反应性模型的优劣。如果综合运用不同特点的模型尤其是能观察记录哮喘发作全过程包括速发和迟发反应的模型,将可以更直接地探索哮喘发病过程和治疗药物。对气道重塑及基因敲除和转基因技术在动物模型中的研究和使用也做了一般性论述。动物模型将是一个有力的工具为最后有效地预防和治疗过敏性哮喘找到突破口。     

整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定

目的：建立整合素相关激酶(ILK)基因敲降和黑色素瘤分化相关基因(mda7)过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列,设计基因敲降靶点序列(A、B、C),通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP,构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒;根据人mda7基因序列,设计引物扩增mda7全长,并插入慢病毒载体pLVX-Puro,构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后,用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体,四质粒系统共转染293T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293T细胞的感染效率在90%以上,并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P<0.05）,mda7的表达水平远高于对照组（P<0.05）,且持续稳定表达至少1个月。ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用,并对其迁移亦有显著抑制（均P<0.05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体,可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具,也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。