人CD226基因SNP和启动子序列分析

目的 研究人CD226（PTA1）启动子及其5‘上游调控序列。方法 应用计算机软件预测启动子序列，并分析人CD226基因5‘上游调控序列以及通过RT－PCR的方法研究开放读框中的单核苷酸多态性。结果 CD226基因在－375bp处和－130bp处可能有两个启动子，含有AP－1，Ets-1,Spl,P300,PU.1,PEA3等转录因子结合序列，在编码胞浆区的序列中存在一个单核苷酸多态性位点。结论 CD226基因表达受到多种转录因子和5‘端上游调控序列的调控。     

人干扰素调节因子3基因启动子的初步鉴定

子活性分析表明,IRF3启动子区域定位于主要转录起始位点区域前111-167 bp的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,该区域内存在E2F转录因子结合位点.结论 -167～-111 bp区存在IRF3启动子的核心调控元件,转录因子E2F可能参与IRF3的转录调控.     

HOXD13调控SOX9基因可能参与先天足部软组织畸形的发生

目的　研究HOXD13与SOX9基因在单纯性马蹄内翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus,ICTEV）足部软组织畸形发生中的分子机制。 方法　软件预测SOX9基因5′上游3个HOXD13结合位点,构建SOX9基因上游不同长度片段以及结合位点野生和突变序列载体,并测定其荧光素酶活性。在体内用ChIP验证HOXD13与SOX9基因启动子区3位点结合作用。干扰HOXD13基因表达,qRT-PCR检测HOXD13和SOX9表达水平的改变。 结果　荧光素酶检测发现在SOX9基因5′上游-1158至-770 bp（位点1）和-512至-368 bp之间（位点3）为负调控区;-770至-512 bp之间（位点2）是正调控区。ChIP检测显示HOXD13蛋白可与SOX9基因位点3结合。干扰HOXD13表达,SOX9基因mRNA表达上调。 结论　HOXD13结合SOX9基因5′上游负调控区可上调SOX9基因表达。干扰HOXD13会上调SOX9基因表达,高表达SOX9基因可能与足踝部软组织的挛缩发生相关。     

HOXD13调控SOX9基因可能参与先天足部软组织畸形的发生

目的　研究HOXD13与SOX9基因在单纯性马蹄内翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus,ICTEV）足部软组织畸形发生中的分子机制。 方法　软件预测SOX9基因5′上游3个HOXD13结合位点,构建SOX9基因上游不同长度片段以及结合位点野生和突变序列载体,并测定其荧光素酶活性。在体内用ChIP验证HOXD13与SOX9基因启动子区3位点结合作用。干扰HOXD13基因表达,qRT-PCR检测HOXD13和SOX9表达水平的改变。 结果　荧光素酶检测发现在SOX9基因5′上游-1158至-770 bp（位点1）和-512至-368 bp之间（位点3）为负调控区;-770至-512 bp之间（位点2）是正调控区。ChIP检测显示HOXD13蛋白可与SOX9基因位点3结合。干扰HOXD13表达,SOX9基因mRNA表达上调。 结论　HOXD13结合SOX9基因5′上游负调控区可上调SOX9基因表达。干扰HOXD13会上调SOX9基因表达,高表达SOX9基因可能与足踝部软组织的挛缩发生相关。     

鉴定调控 L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的转录因子SP-1

目的:鉴定调控 L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的转录因子，进一步阐明非激素依赖型前列腺癌的发病机理。 方法:在鉴定L-plastin启动子近3’端－216到1序列片段存在明显的转录活性的基础上，利用TF SEARCH软件分析该片段的序列，寻找调控L-plastin表达的非甾体激素类转录因子，并用凝胶滞后实验和超滞后实验证实结合于该片段的转录因子，利用PCR定点突变法构建删除该转录因子结合位点的重组子，并检测切除该片段序列后荧光素酶活性变化。 结果:TF SEARCH软件分析表明在距转录起始点-54--41 bp处含有SP-1转录因子结合位点GGTGGGGCGGGGA，凝胶滞后实验和超滞后实验表明SP-1是结合于L-plastin启动子3’端该序列的转录因子，删除SP-1结合位点后荧光素酶活性下降。 结论:SP-1是促进L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的重要调控因子。     

人TSLC1基因核心启动子的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定人TSLC1基因的核心启动子区,用于开展其转录调控机制的研究。方法用PCR方法从人基因组DNA中扩增出TSLC1基因翻译起始位点上游一系列大小不等的片段,连入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中。通过瞬时转染A549及NCI-H446细胞,检测细胞裂解液中的双荧光素酶活性,确定TSLC1基因的核心启动子区。结果在人TSLC1基因启动子区的分段克隆中,ATG上游-68～-329 bp片段在A549及NCI-H446细胞中均具有很强的启动活性,对TSLC1的转录起重要作用。结论人TSLC1基因翻译起始位点ATG上游-68～-329 bp区域可能为基因的核心启动子区。     

鼻咽癌STGC3基因转录调控元件分析与鉴定*

目的：分析并鉴定STGC3基因转录调控元件,探讨鼻咽癌STGC3基因的转录调控分子机制。方法：运用 生物信息学,预测并分析STGC3基因核心启动子区的转录因子结合位点;将相关转录因子结合位点,制备3 种探 针即生物素标记野生型、突变型及未标记野生型;提取CNE2细胞核蛋白,利用电泳迁移率变动分析（ EMSA） 及染色质免疫共沉淀（ ChIP）分析,体内外鉴定转录因子结合位点。结果：在STGC3基因核心启动子区存在21 个转录因子结合位点,其中9 个为Sp1 转录因子结合位点;进一步严格限定参数,STGC3基因核心启动子区域含 有转录因子结合位点5 个,其中Sp1 转录因子结合位点2 个;EMSA和ChIP 实验结果显示,STGC3基因中存在转 录因子Sp1 特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。结论： STGC3基因核心启动子区含有Sp1 特异性结合位点,为该基因的转录调控元件。     

组织特异性表达基因PLUNC调控元件的生物信息学分析

目的分析组织特异性表达基因PLUNC的调控元件。方法采用进化足迹法,结合生物信息学工具,预测PLUNC基因的顺式作用元件和反式作用因子。结果预测的PLUNC基因的转录起始位点位于-1～＋10bp区域间、-29bp存在TATA盒子,启动子集中在-490bp～＋89bp内,在人和小鼠PLUNC基因的启动子保守区内存在29个共同的转录因子结合部位及5个增强子。结论PLUNC基因调控元件的分析可为探讨上呼吸道特异性表达基因的调控机制提供模型。生物信息学技术结合进化足迹法,在基因表达调控机制的研究中具有重要的应用价值。     

人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析

目的 :对在LPS、TNF α刺激下 ,人 β 防御素 2基因 5′ 端转录调控机制进行初步分析。 方法 :将HBD 2基因 5′ 端上游序列连接入无启动子的pEGFP 1质粒 ,构建了系列 5′端缺失的 pEGFP 1 /HBD 2报告质粒。pEGFP 1 /HBD 2质粒转染细胞后给予LPS、TNF α刺激 ,用RT PCR检测 pEGFP的mRNA浓度。 结果 :显示HBD 2基因上游 2 41段有较强的启动子活性 ;LPS、TNF α刺激后 ,即使上游序列缩短至 2 41位点时 ,报告基因 pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD 2基因上游 2 41区域含有LPS、TNF α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明 2 3 2 / 2 2 2区域有一同源性极高的NF kB结合元件 ,提示NF kB结合元件可能调控HBD 2的增强表达     

ULK1启动子区含有抑制ULK1转录的G4结构

目的:研究G四联体(G-quadruplex,G4)结构对UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)基因的转录调控作用。方法:分析ULK1转录起始点上游1 000 bp启动子序列的G/C含量;预测ULK1启动子区G4形成序列,利用圆二色谱、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染鉴定G4;通过构建ULK1启动子报告基因质粒和用G4配体处理人前列腺癌DU-145细胞,结合报告基因检测、RT-qPCR和Western blot实验检测G4对ULK1转录的调控作用。结果:ULK1启动子区G/C含量丰富;预测发现10条G4形成序列;体外实验表明G4形成序列可以形成G4结构;细胞实验表明ULK1启动子区的G4结构负调控ULK1的转录。结论:ULK1启动子区可形成抑制ULK1转录的G4结构。这为揭示ULK1的转录调控机制提供了新的线索。     

人血红素加氧酶基因近端启动子区研究进展

分析血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)基因mRNA加帽位点上游1416bp及mRNA5′端未翻译区24bp全长1.44kb片段。通过大片段缺失,发现与诱导剂相关的mRNA加帽位点近端上游121bp,可使基因的瞬时表达提高3～5倍,同时诱导作用发生在SV_(40)增强子元件位于启动子序列上游。另外在1.44kb片段间mRNA加帽位点上游有沉默子或负调控元件及NF-κB-和AP-2结合位点,而在1.44kb之外还有附加的诱导增强子元件。     

GLI3基因在单纯性马蹄内翻足发生中的调控机制

目的 探讨在单纯性马蹄内翻足发生过程中GLI3基因的凋控机制.方法 构建荧光素酶报告基因表达载体,分析大鼠Gli3基因5′侧翼启动子区域的活性.用P-Match软件预测Gli3基因上游序列中转录因子的结合位点,并通过染色质免疫沉淀实验、凝胶迁移实验验证.用RNA干扰实验以及构建Hoxd13表达载体,观察其在L6细胞中对Gli3基因表达的影响.结果 在大鼠Gli3基因序列的启动子区域发现2个Hoxd13的结合位点,染色质免疫沉淀和凝胶迁移实验证实Hoxd13结合于结合位点2上.Hoxd13表达下调时,Gli3基因表达明显上调.Hoxd13基因表达上调时,Gli3基因则表达下调.结论 在大鼠胚胎肢体发育中,Hoxd13蛋白可能与Gli3基因启动子区的Hoxd13结合位点2结合,调控Gli3的表达.     

诱生型一氧化氮合酶基因启动子的结构及其调控

鼠类NOS2基因5′端1.7kb序列几乎包含了所有的顺式作用元件,其中NFκB结合位点、IRF-RE、CAAT box和GAS等元件对该基因的诱导性转录调控至关重要。人NOS2基因5′端3.7kb范围与鼠类有相似的调控元件,但该区域仅有基础启动子活性,其诱导性调控元件在-3.7kb的上游,其中NFκB结合位点起着关键的作用。     

大鼠睾丸AQP7 的启动子结构和活性分析

目的 :分析AQP7的启动子结构和活性 ,明确调控AQP7基因转录的启动子片段 ,探讨AQP7的表达调控机制 ,研究AQP7基因 5′非编码区 (NCR)在细胞内对AQP7翻译启动功能的作用。方法 :从大鼠基因文库克隆大鼠AQP7基因 5’旁侧区 (flank ingregion)片段 ,大鼠AQP7基因 5’旁侧区片段的纯化、亚克隆及测序鉴定 ,用BLASTN 2 2 4软件将AQP7基因 5’旁侧区片段与GenBank大鼠的基因组数据库匹配比较分析 ,进而分析大鼠AQP75’旁侧区片段中包含的启动子长度、结构、转录起始位点及调节因子框架 ,以此设计 4对引物 ,以大鼠基因组DNA为模…     

顺式作用元件的预测

顺式作用元件是同一DNA分子中具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其它调控基序,在基因转录起始调控中起重要作用;按功能特性分为通用调节元件如启动子、增强子及沉默子和专一性元件如激素反应元件,cAMP反应元件;确定顺式作用元件的试验方法主要有:DNA结构分析、序列分析和基因删除或替换等,软件预测是确定顺式作用元件的另一种方法,但不同软件预测结果差异较大,将试验方法与软件预测相结合能够提高顺式作用元件预测的准确性。     

人TAK1基因启动子活性的研究

目的鉴定人TAK1启动子片段结构,探索调控TAK1基因高水平转录的启动片段。方法利用生物信息学软件分析TAK1基因启动子结构,构建TAK1启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体,脂质体法转染滑膜成纤维样细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性。结果人TAK1基因-260~+25 bp片段具有高转录活性,明显高于其他片段,而-88~+25 bp启动子片段活性最低。结论人TAK1基因-260~-170 bp是主要的转录调控区,是进一步研究DNA结合蛋白的调控靶序列。     

姜黄素调控转录因子FOXP3影响HIV-1感染辅助受体CCR5的作用机制研究

目的：探讨姜黄素通过调控转录因子FOXP3影响HIV-1感染辅助受体CCR5的作用机制。方法：利用生物信息学方法预测并分析转录因子FOXP3与CCR5启动子的结合位点;采用AutoDock 4.2软件对姜黄素与FOXP3进行柔性对接;MTT法检测姜黄素对Jurkat细胞活性的影响;qRT-PCR和Western blot检测不同浓度姜黄素作用于Jurkat细胞后CCR5和FOXP3 mRNA和蛋白表达水平;构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体;结合转录因子预测结果,运用Overlap PCR法扩增突变型CCR5基因片段,构建突变型CCR5启动子报告载体pFireRluc-Mt-CCR5;利用双荧光素酶报告基因技术验证转录因子FOXP3与CCR5的启动子结合位点。结果：JASPAR转录因子预测结果显示,CCR5启动子区与转录因子FOXP3存在结合位点;分子对接结果显示,姜黄素能够与FOXP3的酶活区域结合;MTT结果显示,姜黄素作用24 h后对Jurkat细胞活性产生抑制作用,IC50为34.48μmol/L;qRT-PCR和Western bot结果显示,不同浓度姜黄素作用于J...     

人FAM33A基因启动子的克隆与鉴定

目的 鉴定人FAM33A基因的启动子,为进一步研究其转录调控机制奠定基础.方法 采用5'RACE技术(5'端cDNA快速扩增)鉴定FAM33A的转录起始位点.采用PCR定向克隆、酶切亚克隆等策略,构建FAM33A启动子荧光素酶报告基因.采用LipofectamineTM 2000转染H1299细胞,并通过Dual-LuciferaseGA16A Reporter Assay System进行荧光素酶报告基因活性检测.结果 确定了FAM33A的转录起始位点,构建了覆盖FAM33A 5'端ATG附近约2 kb区域的一系列FAM33A启动子荧光素酶报告基因.启动子活性分析表明,这些重组体均具有较高的启动子活性,同时含有典型的GC盒以及Sp1、E2F和GATA-1等潜在的转录因子结合位点.结论 FAM33A启动子区域主要定位于转录起始位点附近约590 bp的区域内.     

哺乳动物细胞POLK、POLH、POLI基因对甲基硝基亚硝基胍的应答反应及其启动子区转录因子结合部位的生物信息学分析

目的:观察甲基硝基亚硝基胍（MNNG）对培养细胞DNA聚合酶κ、η、ι编码基因表达的影响并用生物信息学方法预测它们的启动子区和启动子区中的转录因子结合部位。方法:利用半定量RT-PCR观察POLK、POLH、POLI基因表达改变。利用在线生物信息学软件，确定它们的启动子区，然后，用转录因子预测软件并结合进化足迹法检出包括启动子区在内的 3 000 bp 碱基上游序列中的转录因子结合部位。结果:0.2 μmol·L-1 MNNG导致细胞POLH和POLI表达水平在处理后6-24 h 间逐渐上升，升高约1倍；而POLK则呈下降；通过转录因子预测软件分析，在POLK 、H和I启动子区分别检出了384个、413个和689个推断的转录因子结合部位；通过进化足迹法分析有效地降低了假阳性率，推断的转录因子结合部位分别下降到158个、80个和40个。结论:低浓度MNNG导致POLH、POLI表达水平升高，而POLK表达水平降低;通过在线软件，我们成功地在POLK，POLH，POLI启动子区分别检出。158、80和40个推断的转录因子结合部位；进化足迹法分析能够有效降低预测软件的假阳性率。     

ASPP2基因启动子区DNA甲基化及转录因子DNA结合位点的干湿研究

对p53凋亡刺激蛋白2 (ASPP2)基因启动子区进行了甲基化及转录因子结合位点(TFBS) 的生物信息学分析及实验研究.结果表明,在该基因近端启动子区存在一个长1391bp的CpG岛,且此区域中包含19个转录因子的37个结合位点,其中有13个转录因子的结合位点含有CpG;甲基化预测发现在含CpG的23个TFBS中有18个位点的CpG易发生甲基化.由此推断ASPP2是典型的多因子调控的CpG岛基因,CpG岛的异常甲基化将影响转录因子结合,导致ASPP2基因表达下调.通过对人肝癌细胞株HepG和人成纤维细胞HFL-1的ASPP2基因启动子CpG岛中含4个E2F结合位点区域的甲基化实验检测,证明这种推断是正确的.这一研究说明,对重要基因启动子区DNA甲基化及TFBS的生物信息学研究可为相关的实验研究提供指南,对促进基因表达的表观遗传调控研究具有重要意义.