一种缺失核定位信号区的hbFGF的表达及纯化

目的：为了研究缺失核定位信号区的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)独特的转运机制，在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达和纯化了缺失核定位信号区的hbFGF。方法：将PCR扩增得到的hbFGF cDNA片断克隆到表达载体pET3c中，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白，MTT法检测促分裂活性。结果：hbFGF的表达量约为全菌体蛋白的20％，纯化的缺失核定位信号区的hbFGF的促分裂活性与缺失核定位信号区的hbFGF标准品相当。结论：BL21(DE3)／pET3c表达系统能高效表达缺失核定位信号区的hbFGF，纯化得到的hbFGF可用于进一步的研究。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子突变体[Ser~(69,87)]的表达、纯化及其稳定性研究

目的:对野生型人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)进行突变改造以提高其稳定性.方法:采用PCR突变方法,将hbFGF cDNA第69位和87位的Cys密码子突变为Ser密码子,所得的突变片断插入表达载体pET3c的表达框架中,构建了表达菌株BL21(DE3)/pET3c-[Ser69,87]hbFGF,IPTG诱导表达.通过离子交换、肝素亲和两步层析的方法分离纯化突变体蛋白[Ser 69,87]hbFGF.MTT法测定重组蛋白的促分裂活性.并对突变体蛋白的抗蛋白酶水解能力、热稳定性及其酸碱稳定性进行了检测.结果:所构建的表达菌株,其[Ser69,87]hbFGF的表达量占菌体总蛋白的30%以上.经两步层析纯化,获得了纯度达98%的突变体[Ser69,87]hbFGF.纯化的样品促Balb/c 3T3细胞增殖的活性与野生型hbFGF相当.突变体[Ser69,87]hbFGF抗胰蛋白酶水解的能力较野生型hbFGF强;热稳定性和酸碱稳定性也较野生型hbFGF高.结论:突变体[Ser69,87]hbFGF的生物学活性与野生型hbFGF相当,其稳定性明显高于野生型hbFGF.     

重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测

目的：高效表达并纯化具有生物学活性的重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)-穿膜肽(tat)融合蛋白,为进一步开发基因工程药物提供实验依据。方法:通过双酶切方法,从质粒pMD18-T-aFGF-tat中获得aFGF-tat基因片段,并将aFGF-tat融合基因与原核表达载体pET3c连接后转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达,将融合蛋白经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化,MTT法检测aFGF-tat融合蛋白对NIH 3T3细的促增殖作用。结果:经酶切和基因测序证实获得的重组人aFGF-tat基因序列与GenBank报道的完全一致,构建的pET3c-aFGF-tat表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达aFGF-tat融合蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符,经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化后蛋白纯度高于95%,Western blotting分析表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力,并能够促进NIH 3T3细胞增殖。结论:成功表达重组人aFGF-tat融合蛋白工程菌,获得aFGF-tat纯蛋白,并证实aFGF-tat融合蛋白具有促细胞增殖活性。     

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础. 方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-T Esay载体中并测序鉴定.将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a( ),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot 鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白. 结果:成功地构建了Id3的原核表达载体.Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白. 结论:重组质粒pET32a( )-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的：HIV-1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法：①PCR法扩增的HIV-1p17基因片段克隆至pET28c质粒;②重组质粒分别在大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS及HMS174(DE3)中表达;③用Ni—NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白;④用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果：重组质粒在BL(DE3)中表达量最高,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32％,纯化后其纯度达95％,纯化蛋白可与p17McAb和HIV-1阳性血清发生特异反应。结论：带有HIV-1p17片段的重组质粒pET28c在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究;用Ni—NTA金属树脂层析法纯化蛋白,方法简便,蛋白丢失少,纯度高;纯化的重组蛋白HIV-1p17可用来临床早期诊断HIV-1感染者,同时可预测患者的临床进程。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

美洲钩虫Ascris型蛋白酶抑制剂1的特性鉴定

目的 制备重组美洲钩虫Ascris型蛋白酶抑制剂1(rNaTIL-1),并观察其抗凝血活性及抑制丝氨酸蛋白酶作用.方法 从美洲钩虫成虫cDNA中扩增获得NaTIL-1编码基因,连接入原核表达质粒pET32a-sumo后转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,重组产物经Ni-NTA亲和层析纯化,纯化柱上...     

抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定

目的:构建和表达一种抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白,在创伤皮肤表面应用时能裂解成有功能的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子,预防伤口感染和促进皮肤修复.方法:利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因.再将两者作为模板,用PCR方法扩增出编码融合蛋白的DNA.将该DNA片段插入到载体pPICZαA中,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd1168中,Zeocin抗性筛选重组转化子.甲醇诱导96 h,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达,并用Western-blot杂交检测融合蛋白的免疫原性.利用肝素亲和层析纯化融合蛋白,同时检测融合蛋白的抑菌和促3T3Bal/b细胞分裂活性.结果:筛选出能表达相对分子质量约为19 kD融合蛋白的重组转化株,SDS-PAGE电泳检测显示甲醇诱导96 h后,融合蛋白表达量达到最高,且能与人酸性成纤维细胞生长因子抗体产生免疫反应.融合蛋白没有抑菌活性,而裂解产物则具有抑菌活性.此外,融合蛋白的促细胞分裂活性与野生型人酸性成纤维细胞生长因子相比没有明显的降低.结论:获得含凝血酶切割位点的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白,并在毕赤酵母中实现了表达.融合蛋白的裂解产物具有抑菌活性.     

绿色荧光标记C-反应蛋白的原核表达和毛细管电泳检测

目的:表达纯化重组的His-EGFP-CRP蛋白,通过毛细管电泳技术对该重组蛋白的生物活性进行评价.方法:用pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化、梯度透析,获得复性的His-EGFP-CRP蛋白;并用高效毛细管电泳(HPCE)技术对复性的蛋白进行检测,了解蛋白质的等电点及活性.结果:转化实验发现,该质粒pET14b/EGFP-hCRP在BL21(DE3)中能够被诱导表达;通过包涵体变性溶解、亲和色谱纯化可获得纯度较高的His-EGFP-CRP蛋白;HPCE分离发现复性后的His-EGFP-CRP蛋白峰为多个,其在电泳液pH值低于6时易检出,His-EGFP-CRP与THP-1细胞裂解物孵育后的检测峰增多.结论:成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白His-EGFP-CRP,通过包涵体变性溶解及亲和色谱纯化获得该重组蛋白,复性后的His-EGFP-CRP等电点接近于6,以单体或多聚体等结构形式存在,具有结合活性,能与细胞内相关分子结合成复合物,可应用于CRP功能和内化机制的研究.     

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

血管内皮生长因子在大肠杆菌中表达?提纯及功能测定

目的:利用细菌表达系统合成大量重组血管内皮生长因子(VEGF)蛋白.方法:将VEGF165 cDNA克隆于表达载体PET-32a( )后转染BL-21株表达重组VEGF蛋白,用分离His蛋白的层析柱提纯重组VEGF蛋白.结果:重组VEGF蛋白经氨基酸序列测定证实.Western blot测定发现His蛋白.功能测定发现重组VEGF蛋白可阻断细胞表面Neuropilin-1的表达.结论:上述表达系统制备大量具有生物活性的重组VEGF蛋白     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的克隆、表达及重新折叠

目的 :人的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand ,TRAIL)基因经扩增后 ,克隆在大肠杆菌中表达并重新折叠并获得有活性的TRAIL蛋白。方法 :用PCR的方法从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,经序列分析鉴定 ,再克隆到原核表达载体 pET11a ,经E .coliBL2 1(DE3)表达 ,电泳鉴定后 ,柱层析纯化 ,重新折叠 ,流式细胞术等方法检测其促凋亡活性。结果 :得到了TRAIL基因 ,并构建了可在大肠杆菌中表达的载体 pET11 TRAIL1(含TRAILcDNA序列 418 933)及可在真核细胞中表达的载体pLNCX TRAIL2 (含TRAILcDNA序列 88 933)。取前者在E .coliBL2 1(DE3)中表达 ,经纯化 ,重新折叠得到了复性的TRAIL蛋白。检测其对人白血病细胞株Jurkat有诱导凋亡的作用。结论 :从人胎盘cDNA文库中扩增TRAIL基因 ,在大肠杆菌中表达、重新折叠、纯化后 ,经检测得到了有活性的TRAIL蛋白     

Expression and purification of recombinant human hemangiopoietin in Escherichia coli

Objective： To express the soluble recombinant hemangiopoietin protein in E. coli BL21 （DE3）. Methods： Using human fetal live cDNA as a template, a partial cDNA fragment of HAPO coding N-terminal region was subcloned into plasmids pTrc99, pQE60 and pET32c to construct different recombinant prokaryotic expression systems. After selecting, the soluble rhHAPO fusion protein was expressed stably in E. coli BL21 （DE3） by vector pET32c-HAPO and further isolated by nickelnitrilotriacetic acid （NTA） affinity chromatography. After cleavage with enterokinase, the rhHAPO protein was applied to Fast Flow SP sepharose column. Results： The rhHAPO protein had a purity of more than 95% and a good bioactivity based on the cell adhesion assay in ECV304 cells. Conclusion： We have established a protein engineering system to produce rhHAPO which may provide the possibility for clinical application     

VEGF与SUMO在大肠杆菌中融合高效表达及纯化

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）与小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）融合并转入大肠杆菌B121中进行VEGF的可溶性高效表达。方法采用PCR扩增方法,获得编码VEGF与SUMO融合蛋白的DNA片段并插入表达载体pET3c中,构建重组表达载体pET3c—SUMO—VEGF,转化到大肠杆菌BL21中,获得重组菌株BL21／pET3c—SUMO—VEGF。以IPTG为诱导剂,对阳性重组菌株的诱导表达参数如诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间等进行优化。结果融合蛋白的最佳表达条件为当OD600约0．6时,加入0．5mMIPTG,20℃诱导24h,获得了纯度达70％以上的SUMO—VEGF。结论通过融合表达。解决VEGF独立表达时表达量低和可溶性差的问题,使其商业化的步伐进一步加快。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。