表达谱基因芯片筛选肝癌细胞中ATRA下游基因的应用研究

目的：全反式维甲酸( All Trans-Retinoic acid, ATRA)处理肝癌细胞系HepG2细胞后进行表达谱基因芯片技术分析,探索其对肝癌细胞基因表达谱的影响。方法80μmol/L的全反式维甲酸处理HepG2细胞24 h后,提取细胞的mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析,以等体积无水乙醇处理作为对照组。结果全反式维甲酸处理HepG2细胞后,共筛选出661个差异表达基因,这些差异基因与肿瘤细胞的信号转导、增殖分化等都有密切的关系。结论成功的应用表达谱芯片技术筛选出ATRA处理细胞后的差异表达基因,为进一步探讨ATRA对肝癌细胞的作用机制奠定了基础,也为临床应用ATRA诱导肝癌分化提供理论依据。     

膈下逐瘀汤对肝癌防治的机理研究

目的:研究膈下逐瘀汤对肝癌Bel-7402细胞和大鼠肝癌组织中PTEN编码蛋白表达的影响,试图进一步阐明膈下逐瘀汤抗肝癌的可能机制。方法:体外实验:采用蛋白印迹试验(Western blotting analysis,WB)检测Bel-7402细胞不同时间PTEN蛋白的表达水平,各治疗组对PTEN蛋白表达水平的影响。体内实验:采用Western blotting analysis检测正常对照组、肝癌模型组、顺铂组、膈下逐瘀汤组、联合治疗组肝癌组织中PTEN蛋白的表达水平。结果:膈下逐瘀汤组作用Bel-7402细胞3 h时PTEN蛋白达到最高水平;与正常对照组、顺铂组、联合治疗组相比,膈下逐瘀汤组药物作用肝癌Bel-7402细胞3h后PTEN蛋白的表达均有明显差异,而联合治疗组治疗作用较膈下逐瘀汤组更为明显。与正常对照组相比,肝癌模型组、顺铂治疗组、膈下逐瘀汤组和联合治疗组PTEN蛋白表达均增高,顺铂治疗组较膈下逐瘀汤组有明显增高PTEN蛋白表达的作用,联合治疗组作用最显著。结论:PTEN蛋白水平的增高可能是膈下逐瘀汤抗肝癌的主要作用机制之一,膈下逐瘀汤与抗肿瘤药顺铂有协同作用。     

甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭迁移的影响及其机制研究

摘要：目的 检测甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭转移的影响并探讨其机制。方法 应用Western blot、免疫组 化以及 Real-time PCR 等方法检测 37 例肝癌及对应癌旁组织标本中 SETDB2 蛋白及 mRNA 表达情况。将靶向 SETDB2 的短发卡 RNA（sh-SETDB2）和空载体（sh-NC）分别转染至人肝癌 MHCC97H 细胞构建稳转细胞系,应用 Tanswell侵袭实验、细胞划痕实验检测2组细胞的侵袭和迁移能力。通过基因芯片检测敲低SETDB2后表达有变化 的基因。敲低SETDB2后,运用Real-time PCR检测PTEN的mRNA的表达变化以及Western blot检测PTEN和组蛋白 H3第9位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）的表达变化,CHIP 检测H3K9me3在PTEN 的启动子区域的变化。在敲低 SETDB2的同时敲低PTEN的表达,Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 （1）Western blot和Real-time PCR的结果均表明肝癌组织中SETDB2蛋白及mRNA表达水平均高于癌旁组织;SETDB2表达的高低与肝癌组织学 分级和TNM分期有关。（2）转染sh-SETDB2的MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力均明显低于sh-NC组。（3）基因芯 片、Western blot以及Real-time PCR等实验结果显示敲低SETDB2后PTEN表达上调。（4）在敲低SETDB2后H3K9me3 表达下调,PTEN启动子区域的H3K9me3减少。（5）与敲低SETDB1组相比,敲低SETDB2的同时敲低PTEN后细胞的 侵袭能力恢复。结论 SETDB2通过下调PTEN的表达促进肝癌细胞的侵袭迁移。     

肝癌中骨形成蛋白2对PTEN蛋白水平影响的研究

目的用骨形成蛋白2(BMP2)干预肝癌细胞系HepG2细胞,从而观察肝癌细胞中PTEN蛋白水平的变化,观察BMP2对PTEN蛋白表达的影响,探讨BMP2与PTEN蛋白水平之间的关系,探索肝癌治疗的新途径。方法将受试对象分为3个组:对照组、BMP2100ng/ml组、BMP2300ng/ml组,作用时间为3个水平:6、12、24h。用免疫组织化学方法测定细胞中PTEN蛋白水平。结果免疫组织化学结果显示在不同浓度BMP2组中HepG2细胞中PTEN蛋白表达差异有统计学意义。不同时间组中PTEN蛋白表达差异有统计学意义。PTEN蛋白阳性表达率在300ng/ml组与100ng/ml组、对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),在6h组与12h组、24h组之间差异有统计学意义(P<0.05)。在300ng/ml、24h组中PTEN蛋白阳性表达最高。浓度与时间之间无交互作用。结论在肝癌中BMP2可以增加PTEN蛋白水平,且呈浓度时间依赖。     

PTEN基因在肝癌中的研究进展

PTEN是磷酸酶蛋白同源基因,在肝细胞中的PTEN的表达和活性的改变非常常见,经常和各种病因的肝脏疾病的分子变异相关,目前越来越多的证据表明,失调PTEN的表达和活动与肝脏的病理过程:乙型/丙型肝炎病毒感染,非酒精性脂肪性肝、酒精性脂肪性肝密切相关,这些疾病可导致PTEN表达或活性失调,其最终结果可能是作为肿瘤抑制基因的PTEN的突变或缺失从而导致肝癌的发生。本文将就近年PTEN基因在肝癌中的的研究进展作一综述。     

全反式维甲酸抑制Ets-1介导的肝癌7402细胞离散和侵袭及其分子机制

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对Ets介导的实体瘤细胞侵袭转移性的影响及探讨其分子机制,寻找新的抗癌药物作用靶点。方法 采用基因转染的方法,将Ets-1基因高表达在低侵袭转移的肝癌7402细胞中,使其增殖、离散侵袭能力增强,再经ATRA处理细胞,用细胞生物学方法检测细胞增殖性、肝癌细胞离散性及穿透Transwell聚碳酯膜能力的改变。并用Northern杂交、Western印迹等分子生物学手段检测ATRA的分子作用机制。结果 发现ATRA可抑制7402细胞因Ets-1高表达而增强的增殖、离散、侵袭性,可下调Ets、c-Met基因的表达,使MAPK、PI3K信号途径中两个关键分子 Erk/Akt的磷酸化水平降低。结论ATRA可能通过下调Ets基因的表达,进而使c-Met表达水平降低,导致MAPK、PI3K信号转导减弱而抑制肿瘤细胞增殖和侵袭;Ets基因可以作为抗癌药物作用的靶点来筛选药物或进行药理研究。     

外源性 AFP 对肝癌细胞增殖和抗凋亡的作用研究

目的：探讨外源性甲胎蛋白（ AFP）对体外培养的肝癌细胞系的生物学功能及意义。方法该实验选用了HepG2（AFP阳性）和HLE（AFP阴性）两种常见的肝癌细胞系,再加入不同浓度的外源性AFP处理24 h后,用MTT检测细胞的增殖情况;在这两种细胞系中加入凋亡诱导剂ATRA处理的同时加入外源性AFP,检测AFP对于细胞的抗凋亡能力的影响。结果在HepG2和HLE细胞中,加入不同浓度的外源性AFP后, MTT结果显示AFP可以明显促进肝癌细胞的增殖;而加入凋亡诱导剂ATRA之后,FCM结果显示细胞凋亡明显增加,加入外源性AFP后,细胞凋亡的情况明显好转,外源性AFP可以增强肝癌细胞的抗凋亡能力。结论外源性AFP不仅可以促进肝癌细胞系的增殖,同时还可以增强肝癌细胞的抗凋亡能力。     

全反式维甲酸联合阿司匹林对体外抑制肺腺癌细胞株A549增殖和促凋亡的作用及其机制

目的：观察全反式维甲酸（ATRA）联合阿司匹林（ASA）体外抑制肺癌A549细胞增殖,促凋亡作用和机制。方法：体外培养人肺腺癌A549细胞,5,10 μmol·L^-1的ATRA单独及分别联合5,10 μmol·L^-1的ASA进行干预48 h、72 h后,MTT法检测细胞增殖抑制率;TUNEL法观测药物作用48 h后细胞凋亡状态;RT-PCR法检测药物作用后肺腺癌A549细胞COX-2 mRNA的表达;Western blot法检测凋亡相关因子Bax、Bcl-2、COX-2和caspase-3蛋白的表达。结果： ATRA与ASA联用对A549增殖具有协同作用;TUNEL法结果显示ATRA可诱导A549细胞凋亡,与ASA联用凋亡率显著升高（P<0.05）;RT-PCR显示A579细胞中COX-2 mRNA呈现高表达状态,ASA可下调COX-2表达,ATRA无此作用;Western blot结果显示ATRA和ASA协同作用使A549细胞中Bcl-2、COX-2蛋白表达受到抑制,Bax蛋白表达增加,Bcl-2/Bax值降低,对凋亡通路的影响大于单药作用（P<0.05）。结论： ASA联合ATRA可协同抑制肺腺癌细胞A549的增殖及以及促进其发生凋亡,其作用机制可能是ASA通过抑制COX-2蛋白表达,与ATRA共同通过Bcl/caspase通路诱导肿瘤凋亡实现的。     

短发夹RNA介导的RNA干扰技术在HepG2.2.15细胞中的应用研究

目的探讨shRNA真核表达质粒介导的RNA干扰技术对HepG2.2.15肝癌细胞中乙型肝炎病毒(HBV)复制及甲胎蛋白(AFP)表达的特异性抑制作用。方法采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)含量;采用微粒子化学发光免疫分析法(MLFA)检测甲胎蛋白含量。采用免疫细胞化学技术检测细胞中HBsAg及甲胎蛋白的表达。结果 pGenesil-shHBV X对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的特异性抑制作用随时间而递增(P<0.05),pGenesil-shAFP对HepG2.2.15细胞甲胎蛋白的特异性抑制作用同样随时间而递增(P<0.05),且二者之间无交叉抑制作用。结论 shRNA真核表达质粒pGene-sil-shHBV X介导的RNA干扰作用可特异性抑制HepG2.2.15细胞HBV的复制表达,pGenesil-shAFP可特异性抑制HepG2.2.15细胞甲胎蛋白的表达,为RNA干扰技术抗病毒及抑制肿瘤的进一步研究奠定基础。     

PTEN和LIVIN在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的表达及临床意义

目的:探讨PTEN和LIVIN蛋白在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的表达及其临床意义。方法:选取本院2008年7月至2011年5月初治的弥漫大B细胞淋巴瘤组织标本41例,反应性淋巴结增生21例作为对照组,采用免疫组化S-P法检测PTEN和LIVIN的表达,并探讨PTEN和LIVIN的表达与弥漫大B细胞淋巴瘤的分期及预后的关系。结果:PTEN在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中表达率为39.00%,对照组表达率为80.95%(P<0.05);LIVIN在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中表达率为65.90%,对照组表达率为23.81%(P<0.05)。弥漫大B细胞淋巴瘤组织切片PTEN与LIVIN表达存在显著的负相关。PTEN与患者性别、年龄、行为评分、Ann Arbor-Colswolds分期、结外受累、乳酸脱氢酶(LDH)高低、临床B组症状、IPI及病理类型无关。LIVIN表达与患者性别、年龄、Ann Arbor-Colswolds分期及是否有结外受累无关;与行为评分分组、LDH高低、临床是否伴有B组症状、IPI及病理类型有关。结论:PTEN在弥漫大B细胞淋巴瘤中低表达,与弥漫大B细胞淋巴瘤预后无相关性。LIVIN在弥漫大B细胞淋巴瘤中高表达,与患者行为评分分组、LDH高低、临床是否伴有B组症状、IPI及病理类型有关。LIVIN可作为判断弥漫大B细胞淋巴瘤预后的生物学指标。     

经动脉介入联合射频消融加体外热疗治疗肝脏恶性肿瘤的临床疗效

目的探讨经动脉介入联合射频消融加体外热疗治疗原发性肝癌及转移性肝癌的临床疗效,进行评价。方法选取医院于2008年10月至2012年12月收治的100例原发性性肝癌、肝转移癌患者,随机分为联合治疗组（50例）和对照组（50例）二组,对照组患者应用肝动脉化疗栓塞术（TACE）进行治疗,联合治疗组为在TACE后1周复查可见有实体肿瘤的患者,对其应用射频消融及体外高频热疗治疗;对比二组患者转移率、生存率、缓解率和生存期,以及患者肿瘤标记物（AFP）情况,运用统计学方法进行评价。结果联合治疗组AFP值下降情况优于对照组,治疗有效率较高,转移率低。结论联合治疗较单纯TACE术能更好地改善患者血清AFP水平;加大肿瘤坏死效果、减小肿瘤体积;降低肿瘤的转移率、复发率,延长患者生存期。     

Auranofin promotes retinoic acid- or dihydroxyvitamin D3-mediated cell differentiation of promyelocytic leukaemia cells by increasing histone acetylation

BACKGROUND AND PURPOSE: To investigate the molecular mechanism for the effect of auranofin on the induction of cell differentiation, the cellular events associated with differentiation were analysed in acute promyelocytic leukaemia (APL) cells. EXPERIMENTAL APPROACH: The APL blasts from leukaemia patients and NB4 cells were cotreated with auroanofin and all-trans-retinoic acid (ATRA) at suboptimal concentration. The HL-60 cells were treated with auroanofin and a subeffective dose of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2 vit D3) in combination. The effect of auroanofin was investigated on histone acetylation at the promoter of differentiation-associated genes and expression of cell cycle regulators. KEY RESULTS: Treatment with auroanofin and ATRA cooperatively induced granulocytic differentiation of fresh APL blasts isolated from patients and NB4 cells. The combined treatment also increased reorganization of nuclear PML bodies and histone acetylation at the promoter of the RARbeta2 gene. Auroanofin also promoted monocytic differentiation of the HL-60 cells triggered by subeffective concentration of 1,25(OH)2 vit D3. The combined treatment of auroanofin and 1,25(OH)2 vit D3 stimulated histone acetylation at p21 promoters and increased the accumulation of cells in the G0/G1 phase. Consistent with this, the expressions of p21, p27 and PTEN were increased and the levels of cyclin A, Cdk2 and Cdk4 were decreased. Furthermore, the hypophosphorylated form of pRb was markedly increased in cotreated cells.Conclusions and implications:These findings indicate that auroanofin in combination with low doses of either ATRA or 1,25(OH)2 vit D3 promotes APL cell differentiation by enhancing histone acetylation and the expression of differentiation-associated genes.     

全反式维甲酸提高人结肠癌LoVo细胞对奥沙利铂敏感性

目的探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,AT-RA)提高人结肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的药物敏感性和机制。方法MTT法筛选ATRA和奥沙利铂实验浓度。流式细胞仪检测ATRA对细胞周期的影响。分别用ATRA、奥沙利铂、ATRA联合奥沙利铂作用LoVo细胞;MTT法检测药物抑制率,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,原子光谱吸收仪检测细胞DNA含铂(Pt)量。结果奥沙利铂抑制LoVo细胞作用呈量效依赖;其GI50(GI,inhibit net cell growth by%)为6.5mg.L-1,主要阻滞肿瘤细胞在S期。ATRA抑制LoVo细胞作用呈时效和量效依赖。1.0μmol.L-1ATRA作用12h后G1期细胞增多;48h后伴S期、G2/M期细胞减少并明显抑制肿瘤细胞增殖;作用12h至48h后联合奥沙利铂,两药联合由相加作用转变为协同作用;联合用药后S期细胞明显增多,细胞DNA含Pt量明显增加,但不提高奥沙利铂凋亡率。结论小剂量ATRA通过改变LoVo细胞周期和提高细胞DNA含Pt量,明显增加肿瘤细胞对奥沙利铂的药物敏感性。     

高尔基体糖蛋白73在58例肝癌患者诊断中的应用

目的探讨GP73对原发性肝癌的诊断价值。方法免疫组化法检测肝癌组织、癌旁组织及正常肝脏组织中高尔基体糖蛋白73（golgiprotein-73,GP73）和甲胎蛋白（alpha—fetoprotein,AFP）的表达,ELISA法检测肝癌患者血清GP73和AFP浓度。结果GP73蛋白在肝癌组织强表达,癌旁组织细胞浆表达较弱,正常肝脏组织无表达,58例肝癌组织中GP73阳性为55例,AFP阳性为40例,两者诊断肝癌的阳性率差异有统计学意义（P〈0．05）;58例PHC患者GP73平均浓度为（238．1±121．6）ng／mL,42例GP73阳性,敏感性为72．4％;AFP平均浓度为（885．6±498．6）ng／mL,30例AFP阳性,敏感性为51．7％,GP73和AFP联合检测能将敏感性提高到85．9％（50／58）;PHC患者肿瘤大小之间、肿瘤个数之间血清GP73浓度无确切关系。结论GP73是一个诊断PHC良好的血清标志物,其敏感性和特异性均较好,GP73和AFP联合检测可以提高早期肝癌的检出率。     

MMP-2和PTEN蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨肝癌组织中MMP-2和PTEN的表达及两者与肝癌侵袭性的关系.方法 用免疫组化SP法检测61例肝癌组织和17例正常肝组织中MMP-2和PTEN蛋白质的表达,并分析两者与肝癌临床病理特征,侵袭性的关系.结果 HCC中PTEN阳性表达率明显弱于正常肝组织,而MMP-2阳性表达率明显高于正常肝组织,且两者呈负相关;PTEN蛋白阳性表达率与HCC组织分化程度、侵袭性有关(P＜0.05),而与性别、术前AFP水平无关(P＞0.05);MMP-2阳性表达率与HCC组织侵袭性有关(P＞0.05),而与HCC组织分化程度、性别、术前AFP水平无关(P＜0.05).结论 PTEN、MMP-2的表达一定程度上反映HCC侵袭性强弱;PTEN缺失可引起MMP-2表达增加,在HCC侵袭、转移中发挥作用.     

肝细胞癌细胞株HepG2细胞甲胎蛋白基因沉默对Survivin表达的影响

目的 研究肝细胞癌细胞株HepG2细胞甲胎蛋白基因沉默(即基因不表达或表达量极低)对Survivin表达的影响.方法 应用siRNA技术对肝细胞癌细胞株HepG2细胞中甲胎蛋白基因的表达进行下调,应用ELISA法(即酶联免疫吸附测定法)对转染前后上清液甲胎蛋白的浓度进行测定,应用MTT比色法对转染前后细胞存活和生长情况进行检测,应用流式细胞术对细胞凋亡率进行分析,应用逆转录PCR技术对转染前后细胞Survivin mRNA水平进行检测.结果 与转染前相比,转染后研究组的上清液中甲胎蛋白的浓度均发生逐渐降低,且转染48 h后,观察组的下降更为明显.观察组的吸光度明显逐渐下降,肝癌细胞生长活性减弱了45.23％;HepG2细胞的凋亡率增至36.8％,较转染前升高了24.4％,HepG2细胞中Survivin mRNA表达下降了74.32％.对于上述情况,空白组和对照组均未见明显的变化.结论 肝细胞癌细胞株HepG2细胞甲胎蛋白基因沉默可抑制Survivin mRNA表达,从而降低肝癌细胞的生长活性以及增加细胞的凋亡率.     

原发性肝癌血清 AFP、AFP-L3表达与 CT 影像的关系

目的：探讨原发性肝癌患者血清甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP-L3）与 CT 征象的相关性。方法选择2012年2月至2015年3月本院收治的64例原发性肝癌患者作为研究对象,均经手术切除且病理证实,另外选取医院同期确诊的肝硬化患者60例,患者均行多层 CT 常规与增强扫描,ELISA 法测定血清 AFP、AFP-L3,分析 CT 扫描联合 AFP、AFP-L3在原发性肝癌诊断中价值,AFP、AFP-L3表达水平与 CT 征象的相关性。结果 AFP、AFP-L3阳性表达在包膜不完整情况下明显高于包膜完整情况（P ＜0．05）;肿瘤临床分期越晚 AFP、AFP-L3阳性表达率越高（P ＜0．05）,肝细胞癌中 AFP、AFP-L3阳性表达率高于胆管细胞癌（P ＜0．05）,有转移患者AFP、AFP-L3阳性表达率高于非转移者（P ＜0．05）。结论检测血清 AFP、AFP-L3联合 CT 扫描在诊断原发性肝癌方面有重要意义,血清 AFP、AFP-L3表达与原发性肝癌 CT 影像中肿瘤大小及包膜情况、肿瘤临床分期、病理类型、转移有一定相关性。     

原发性肝癌病人血液指标实验室检测的调查研究

目的:观察原发性肝癌(PLC)病人血液实验室检测指标的异常情况,为PLC的筛查提供遴选合适的有价值的血液检测实验室项目.方法:检测47例PLC组及48例健康对照组的血细胞计数及血清AFP、AFU、CA199、CEA、GGT、ALP、CRP值.结果:PLC组血小板、白细胞、淋巴细胞计数均较健康对照组低,其异常发生率也高于健康对照组,而且以异常减少较为常见.PLC组病人AFP、A-FU、CA199、CEA、GGT、ALP、CRP测定值与异常发生率均较健康对照组高,其异常发生率范围为19.2～83.0%.在AFP与AFU之间;GGT与AFP、AFU、ALP之间:ALP与AFP、AflJ、CEA、CA199之间存在不同程度的正相关关系.结论:PLC可能会引起血小板、白细胞数、淋巴细胞计数减少.联合检测AFP、AFU、GGT、CA199、ALP、CRP、CEA及血细胞计数等实验项目有助于PLC诊断的筛查.