腺病毒介导Cx43基因修饰对急性白血病骨髓基质细胞GJIC功能的影响

目的观察急性白血病骨髓基质细胞(acute leukemia bone marrow stromal cells,ALBMSCs)经腺病毒介导的间隙连接蛋白43(Cx43)基因修饰后Cx43基因表达的变化以及对细胞间隙连接通讯(GJIC)功能的影响。方法用重组腺病毒Ad-Cx43-GFP转染ALBMSCs,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达并计算转染效率,RT-PCR法、Westernblot法和免疫细胞化学法检测ABMSCs转染前后Cx43基因及蛋白表达情况,通过染料传输实验观察细胞间隙连接通讯功能的变化。结果荧光显微镜下观察可见ALBMSCs在转染Ad-Cx43-GFP后24h即有绿色荧光表达,计数绿色荧光细胞的百分率得出转染效率为(82.7±2.16)%;RT-PCR法、Westernblot法和免疫细胞化学法检测显示转染Ad-Cx43-GFP后ALBM-SCsCx43基因及蛋白表达较转染前增强(P<0·01);转染Ad-Cx43-GFP后ALBMSCs GJIC功能较转染前增强(P<0·01)。结论腺病毒介导Cx43基因修饰ALBMSCs后可上调其Cx43基因的表达并增强GJIC功能。     

Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43（Cx43）和绿色荧光蛋白（GFP）双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果（1）通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;（2）重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;（3）同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;（4）荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;（5）利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。     

LKB1通过增强间隙连接细胞通讯增加乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的研究LKB1对乳腺癌细胞顺铂化学敏感性的作用及机制。方法构建LKB1高表达的稳定转染细胞MDA-MB-231/LKB1及其空载对照细胞MDA-MB-231/VEC。RT-PCR、Western印迹法检测细胞间隙连接蛋白Cx26、Cx32、Cx43和Cx50的核酸、蛋白水平表达;免疫荧光实验对Cx43进行胞内表达定位;染料传输实验评估间隙连接细胞通讯功能;细胞毒实验检测顺铂杀伤乳腺癌细胞的＂旁观者效应＂及计算顺铂的半数抑制浓度。结果 LKB1增加了间隙连接蛋白Cx43的核酸及蛋白水平表达（P〈0.01）,但对Cx26、Cx32及Cx50的表达水平无明显影响。LKB1增加了细胞膜上Cx43的表达,增强了细胞传递荧光黄染料的能力,并使顺铂对细胞的旁观者杀伤效应增强。LKB1也增加了细胞对顺铂的敏感性,MDA-MB-231、MDA-MB-231/VEC和MDA-MB-231/LKB1的半数抑制浓度分别为22.46、24.72、6.55 nmol/L,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 LKB1通过增强乳腺癌细胞的Cx43表达及间隙连接细胞通讯功能增强了顺铂的旁观者杀伤效应,并增加了细胞对顺铂的敏感性。     

原代培养大鼠肝细胞的基因转染

目的：研究原代培养大鼠肝细胞的基因转染的方法．方法：采用胶原酶灌注法获取原代培养大鼠肝细胞．利用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(GFF)和Neo基因的真核细胞表达载体(pEGFP-N3)转染原代培养大鼠肝细胞．用荧光显微镜观察和Neo基因原位杂交染色方法检测肝细胞内基因表达情况．结果：获取的原代大鼠肝细胞活细胞率达95％,荧光显微镜下观察可见转染基因的细胞可发出绿色荧光,原位杂交显示有Neo基因的表达．结论：pEGFP-N3基因可转入大鼠肝细胞并获得表达,可用于标记原代培养的大鼠肝细胞,有利于研究肝细胞移植后移植的肝细胞在体内的分布及功能．     

MafA真核表达载体的构建及在人肝癌细胞中的表达

目的:构建肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)真核表达载体pEGFP-N2/MafA,pEGFP-C1/MafA,观察MafA在人肝癌细胞HepG-2细胞内的表达.为研究Mafa基因功能和作用机制奠定基础.方法:提取胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,在两端分别引入Hind Ⅲ和Sal Ⅰ的酶切位点.重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中,用脂质体方法转染至人肝癌细胞HepG-2细胞中,通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulin Ⅱ基因的表达.结果:通过RT-PCR获取了MafA基因并成功克隆人载体,转染的细胞有绿色荧光蛋白表达及MafA基因表达,但没检测到insulin Ⅱ基因表达.结论:成功构建质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,并成功表达MafA 基因,但没有insulin Ⅱ基因的表达.     

小鼠IDO真核表达载体的构建及其在未成熟树突状细胞中的表达

目的 构建小鼠pEGFP-N1-IDO真核表达载体并观察其在未成熟树突状细胞中的表达.方法 利用RT-PCR方法扩增小鼠IDO基因全长,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pEGFP-N1.经酶切和测序鉴定后, 用DOTAP脂质体转染法转染未成熟树突状细胞.通过G418筛选, 用倒置荧光显微镜观察转染的未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR、Western blot检测IDO的表达.结果 小鼠全长IDO基因序列正确插入pEGFP-N1载体,与GenBank中报道的序列一致,成功构建了pEGFP-N1-IDO真核表达载体,并转染未成熟树突状细胞,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和转染未成熟树突状细胞,并证明能有效表达于未成熟树突状细胞中 .     

木犀草素增强Cx32/Cx26组成的细胞缝隙连接功能

【目的】 体外观察木犀草素对转染并稳定表达缝隙连接蛋白32/ 26(Cx32/Cx26)的Hela细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)和Cx26蛋白表达水平的影响。【方法】 用SRB法检测不同浓度木犀草素对Hela细胞的毒性;用细胞接种荧光示踪法观察不同浓度木犀草素对GJIC的影响;用western blotting 研究木犀草素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx26表达的影响。【结果】 木犀草素在0 ~ 1 μmol/L浓度时对Hela细胞无毒性作用;木犀草素(0.01 ~ 1 μmol/L)能浓度依赖性地增强GJIC及Cx26蛋白表达量。【结论】木犀草素增强转染并稳定表达Cx32/Cx26的Hela细胞GJIC;这种增强作用可能与其增加Cx26蛋白表达水平有关。     

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43(Cx43)cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞,观察间隙连接蛋白Cx43在骨髓基质干细胞中的过量表达．方法：目的基因Cx43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3．0,转染大鼠骨髓基质干细胞,用G418筛选得到Cx43基因高表达的细胞;对照组为pcDNA3．0直接转染骨髓基质干细胞．结果：酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3．0-Cx43,经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞,免疫细胞化学显示有Cx43蛋白的表达．结论：Cx43可以在骨髓基质干细胞中表达．     

绿色荧光蛋白-EGFRv Ⅲ真核表达载体的构建及在Tca8113细胞中的表达

目的 构建含有表皮生长因子受体Ⅲ型变异体(EGFRvⅢ)的增强型绿色荧光蛋白表达载体,转染到舌癌Tca8113细胞中,建立稳定表达的细胞系,为研究EGFRvⅢ在舌癌细胞传导通路中的作用奠定实验基础.方法 以从人乳腺癌细胞中提取的总RNA为模板经反转录为cDNA,用RT-PCR的两步法扩增得出含有HindⅢ和Xhol的EGFRvmⅢ目的 基因连接到绿色荧光蛋白pEGFP-N1载体上.将重组质粒通过脂质体转染的方法转染到舌癌细胞中观察,以G418筛选表达目的 基因的单细胞系并通过RT-PCR的方法进行目的 基因的表达水平检测.结果 经过PCR引物扩增得到1218bp基因片段,生物公司测序正确,重组质粒pEGFP-N1-EGFRvⅢ经双酶切分析检测无误;质粒转染舌癌细胞可见荧光信号表达,经过G418筛选后成功获得细胞克隆株.结论 成功构建pEGFP-N1-EGFRvⅢ表达载体,并能够在舌癌细胞中高度表达,为研究EGFRvⅢ在舌癌MAPK传导通路中的作用建立细胞模型奠定了实验基础.     

缝隙连接蛋白Cx26/Cx32对依托泊苷抗肿瘤作用的影响

目的观察宫颈癌Hela细胞中缝隙连接蛋白Cx26/Cx32对依托泊苷抗肿瘤作用的影响。方法采用荧光示踪实验检测Hela细胞中由Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能,及药物(油酸酰胺,维甲酸)对其功能的影响;采用标准细胞集落形成分析法检测Hela细胞中由Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能改变后,依托泊苷对Hela细胞生长抑制作用的影响;采用Hoechst33258荧光染色检测缝隙连接通讯功能改变后,依托泊苷对Hela细胞诱导凋亡作用的影响。结果荧光示踪实验结果显示油酸酰胺可显著降低缝隙连接通讯功能,而维甲酸则可增强该功能;标准细胞集落形成实验结果表明,在缝隙连接形成的Hela细胞中,油酸酰胺显著降低依托泊苷对Hela细胞生长的抑制作用,而维甲酸则增强依托泊苷的细胞生长抑制作用;Hoechst 33258荧光染色结果显示,在缝隙连接形成的Hela细胞中,油酸酰胺显著降低依托泊苷对Hela细胞的诱导凋亡作用,而维甲酸则增强依托泊苷的诱导凋亡作用。结论宫颈癌Hela细胞中缝隙连接蛋白Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能降低,依托泊苷的抗肿瘤作用下降;而当通讯功能增强时,其抗肿瘤作用则增加。     

黄芩素对缝隙连接蛋白Cx32组成的GJIC功能的影响

目的:在转染并稳定表达Cx32的HeLa细胞上,观察黄芩素对Cx32组成的GJIC及Cx32蛋白表达水平的影响。方法:细胞接种荧光示踪法观察不同浓度黄芩素对GJIC的影响;细胞免疫荧光法观察黄芩素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx32蛋白表达的影响。结果:黄芩素(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)增强Cx32组成的GJIC功能的荧光渗透率为10.04%,22.5%和35.33%;黄芩素(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)增强组成GJIC的Cx32蛋白表达的荧光强度为(27.12±0.30)%,(56.31±1.02)%和(83.47±1.85)%。结论:黄芩素可增强缝隙连接蛋白Cx32组成的GJIC功能,其机制可能与增加Cx32蛋白表达水平有关。     

不稳定逼尿肌Cx43基因表达及其与逼尿肌细胞间缝隙连接通讯功能的关系研究

目的研究连接蛋白Cx43基因在体外培养不稳定逼尿肌细胞中的表达及不稳定逼尿肌细胞间缝隙连接通讯(gap junction intercelluar communication,GJIC)功能的变化,初步探讨二者与逼尿肌不稳定(destrusor instability,DI)的关系.方法健康雌性Wistar大鼠40只,分为DI组和正常组.RT-PCR及Western blot法检测各组逼尿肌细胞中Cx43 mRNA及蛋白表达变化,划痕标记荧光染料示踪技术(SLDT)检测各组逼尿肌细胞间GJIC功能变化.结果RT-PCR及Western blot检测结果显示DI组逼尿肌细胞中Cx43 mRNA及蛋白含量明显高于正常组(P＜0.01),SLDT结果表明DI组逼尿肌细胞间GJIC明显强于正常组(P＜0.01).结论体外培养不稳定逼尿肌细胞中Cx43基因表达增加,细胞间GJIC增强,二者可能与DI的发生有密切关系.     

Cx43蛋白在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞通讯功能的影响

探讨细胞间隙连接蛋白Ｃｘ４３在人子宫吕细胞系ＨｅＬａ中表达,及其对细胞间隙连接通讯的影响。方法应用流式细胞仪以及ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ划痕记荧光舆技术,研究维甲酸作用对ＨｅＬａ细胞Ｃｘ４３蛋白表达,以及细胞生长状态和间隙连接通讯功能的调节作用。     

慢性脑低灌注对海马区缝隙连接超微结构和缝隙连接蛋白的影响

目的 观察慢性脑低灌注导致的认知功能受损的大鼠海马区缝隙连接超微结构的变化以及缝隙连接蛋白亚单位的表达变化.方法 通过永久性双侧颈总动脉结扎模型(2-VO)诱导大鼠慢性脑低灌注状态.实验动物分为对照组、2-VO 3周组、8周组和12周组.Morris水迷宫检测空间学习和记忆能力,透射电镜观察大鼠的海马CAI区缝隙连接,逆转录-多聚酶联反应和Western印迹技术检测海马中缝隙连接蛋白(Cx)Cx36、Cx32和Cx26的表达.结果 在水迷宫训练期的3～5 d,手术组大鼠找到平台的潜伏期均显著长于对照组.空间探索实验中对照组在目标象限游泳时间显著长于手术组.所有手术组动物的缝隙连接超微结构都发生了变化.与对照组相比,Cx36转录和翻译水平在手术后3周、8周和12周组均显著降低,mBNA表达量分别为1.533±0.138、0.466±0.086、0.495±0.104、0.626±0.089,蛋白表达量分别是0.982±0.089、0.351±0.056、0.557±0.072、0.595±0.039(均P<0.01).与对照组相比,Cx32的转录和翻译水平在术后3周、8周和12周组均显著降低,mRNA表达量分别为1.215±0.128、0.237±0.079、0.471±0.083、0.556±0.105,蛋白表达量分别为1.089±0.050、0.401±0.055、0.712±0.074、0.837±0.048(均P<0.05或P<0.01).Cx26的转录水平在手术组无显著性改变,蛋白水平较对照组上调,蛋白表达量分别为0.435±0.047、0.635±0.047、1.396±0.056、0.797±0.051(均P<0.05或P<0.01).结论 这些实验结果提示缝隙连接的变化参与了慢性脑低灌注导致的认知功能损伤.     

星形胶质细胞中缝隙连接蛋白connexin 43的表达及其功能调控

目的研究星形胶质细胞中缝隙连接蛋白connexin43（Cx43）的表达及由其形成的缝隙连接通讯功能的药物调控。方法
实验分为正常对照组、全反式维甲酸组（10µmol/L全反式维甲酸作用24h）及油酸酰胺组（25µmol/L油酸酰胺作用2h）。
western blotting法检测各组星形胶质细胞中Cx43总蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测各组星形胶质细胞Cx43胞膜蛋白的表
达;荧光示踪法检测各组星形胶质细胞的缝隙连接通讯功能。结果与正常对照组相比,全反式维甲酸能增强星形胶质细胞中
Cx43总蛋白的表达（P<0.01）,油酸酰胺则能减弱其表达（P<0.01）;全反式维甲酸能增强Cx43胞膜蛋白表达,油酸酰胺能减弱其
表达;全反式维甲酸能增强星形胶质细胞缝隙连接通讯功能（P<0.01）,而油酸酰胺则可显著降低该功能（P<0.01）。结论药物
全反式维甲酸及油酸酰胺可以对星形胶质细胞缝隙连接通讯功能进行调控,其机制可能与其影响星形胶质细胞Cx43总蛋白和
胞膜蛋白的表达有关。
     

大鼠脑损伤运动障碍模型中移植脂肪干细胞来源的施旺细胞后细胞缝隙连接在神经功能修复中的作用

目的证明移植脂肪干细胞及其诱导分化而来的施旺细胞有利于急性脑损伤动物模型的功能恢复。探索细胞移植后缝隙 连接在脑损伤修复过程中的作用机制。方法在运动皮层损伤偏瘫大鼠模型中,将培育分化得到的脂肪干细胞及施旺细胞以及 RNAi技术沉默Cx43基因的施旺细胞移植损伤灶处行原位培养,术后观察大鼠运动功能恢复情况并予评分。移植7 d后处死取 鼠脑组织,RT-PCR和Western blot验证神经生长因子（NGF）的表达水平。结果在建立的运动皮层损伤的偏瘫大鼠模型,细胞 移植组大鼠优于对照组运动评分。WB结果中对照组NGF表达明显低于各移植组,Cx43基因沉默的施旺细胞移植后组织NGF 表达低于未沉默组,Cx43基因未沉默组与脂肪干细胞移植组无显著性差异。RT-PCR法测得对照组NGF mRNA水平明显低于 各移植组,施旺细胞组水平高于脂肪干细胞组、高于Cx43基因沉默施旺细胞组。结论移植脂肪干细胞和其经诱导分化而来的 施旺细胞,都有利于动物模型的脑损伤后功能恢复。在脑损伤修复期功能性缝隙连接形成过程中,缝隙连接蛋白Cx43发挥了 重要作用,可能通过促进神经生长因子NGF的表达有关。     

丙戊酸钠对乳腺癌细胞缝隙连接功能的增强作用及其机制

目的探讨丙戊酸钠对乳腺癌细胞Hs578T缝隙连接功能的影响及其可能机制。方法MTT法检测丙戊酸钠的细胞毒
性;细胞接种荧光示踪法测定Hs578T细胞之间荧光传递功能;Western blotting检测丙戊酸钠对Cx43总蛋白表达的影响;细胞
免疫荧光法观察丙戊酸钠对Hs578T细胞膜Cx43蛋白表达的影响。结果MTT检测结果显示丙戊酸钠在0~10 mmol/L浓度范
围内对Hs578T细胞几乎无细胞毒性;细胞接种荧光示踪结果显示丙戊酸钠0~5 mmol/L显著增强Hs578T细胞荧光传递功能
（P<0.01）;Western blotting结果显示丙戊酸钠0~5 mmol/L可显著增强Cx43总蛋白表达（P<0.01）;细胞免疫荧光结果显示丙戊
酸钠0~5 mmol/L可显著增强Hs578T细胞膜Cx43蛋白的表达。结论丙戊酸钠能够显著增强乳腺癌细胞Hs578T的缝隙连接
功能,这种增强作用可能与其增强Cx43总蛋白和细胞膜Cx43蛋白表达水平有关。
     

HSVtk/GCV介导的旁观者效应对人膀胱癌的作用机理

目的研究单纯疱疹病毒胸腺苷激酶基因(HSVtk)联合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对人膀胱癌细胞(BIU87)的旁观杀伤作用,探讨旁观者效应产生的机制.方法将携带HSVtk基因的细胞BIU87-TK与BIU87混合培养,观测HSVtk/GCV系统的旁观者效应.染料划痕标记观察细胞间缝隙连接功能;RT-PCR 检测连接蛋白Connexin26 (Cx26) mRNA表达.同时观测维甲酸对缝隙连接和旁观者效应的影响.结果当BIU87-TK占40%时,共培养细胞对GCV的杀伤敏感性接近60%,显示出旁观者效应.大量细胞凋亡.划痕实验见染料传至临近细胞,RT-PCR 检测出Cx26mRNA表达(0.15).维甲酸处理后,染料传递至更多细胞,Cx26mRNA表达增加到0.34, HSVtk/GCV的旁观者效应随之提高.结论 HSVtk/GCV对人膀胱癌细胞具有旁观杀伤作用,其机理与细胞间缝隙连接和凋亡有关.维甲酸能增强细Cx26表达和缝隙连接功能,提高旁观者效应.